Wiederholbarer Nachweis von Ag+-Ionen mithilfe eines DNA-Aptamers

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 9692 (2022) Diesen Artikel zitieren

1887 Zugriffe

4 Zitate

3 Altmetrisch

Details zu den Metriken

In diesem Artikel wird der wiederholbare Nachweis von Ag+-Ionen mithilfe eines biochemischen DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogel-Sensors beschrieben, der in ein mikrofluidisches Heizsystem integriert ist. Biochemische Sensoren, die auf chemische Verbindungen reagieren und nachweisbare Signale erzeugen, spielen in vielen Aspekten der modernen Gesellschaft eine entscheidende Rolle. Insbesondere durch die wiederholbare Messung von Umweltinformationen wie toxischen Substanzen einschließlich Ag+-Ionen ist eine Verbesserung der Umwelt zu erwarten. Das DNA-Aptamer ist aufgrund der Stabilität und Selektivität der Bindung an Chemikalien ein attraktiver Kandidat. Bisherige biochemische DNA-Aptamer-Sensoren konnten jedoch nicht wiederholt messen, da diese Sensoren keine Initialisierungsfunktionen hatten. Um diese Herausforderung zu meistern, haben wir einen biochemischen DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogel-Sensor vorgeschlagen, der in das mikrofluidische Heizsystem integriert ist und eine wiederholbare Detektion von Ag+-Ionen ermöglicht. Die bindenden Ag+-Ionen werden durch Erhitzen und Spülen durch die integrierte mikrofluidische Heizvorrichtung dissoziiert. Das DNA-Aptamer-verknüpfte Hydrogel war in der Lage, einen weiten Bereich von Ag+-Ionenkonzentrationen (10–5–10 mM) nachzuweisen, einschließlich eines toxischen Bereichs für verschiedene Wasserorganismen. Schließlich haben wir den wiederholbaren Nachweis der Ag+-Ionen demonstriert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass unser vorgeschlagener biochemischer Sensor voraussichtlich zur Langzeitüberwachung mit hoher Stabilität der Umgebungstemperatur und geringem Stromverbrauch eingesetzt werden kann.

Biochemische Sensoren, die auf chemische Verbindungen reagieren und nachweisbare Signale erzeugen, spielen in vielen Bereichen der modernen Gesellschaft eine entscheidende Rolle, da der Mensch viel weniger empfindlich auf die chemische oder biologische Umgebung reagiert als auf die physische Umgebung wie Licht, Druck, Temperatur oder Feuchtigkeit1. Beispielsweise spiegeln die spezifischen Moleküle im menschlichen Körper wie Metaboliten, Metallionen und Hormone die Gesundheit der Person wider, während Chemikalien in der Umwelt, darunter Schwermetalle, Sprengstoffe und Giftstoffe, Auswirkungen auf Pflanzen und Tiere, einschließlich des Menschen, haben können2,3. Um die Gesundheit einer Person zu fördern und die Umwelt zu verbessern, wird dringend erwartet, dass solche biometrischen und Umweltinformationen wiederholt über einen langen Zeitraum gemessen werden. Im Hinblick auf die Realisierung wiederholbarer Messungen über einen langen Zeitraum wird die Entwicklung hochempfindlicher und wiederholbarer biochemischer Sensoren erwartet.

Obwohl verschiedene Arten von biochemischen Sensoren entwickelt wurden4,5,6,7, rücken funktionelle Nukleinsäuresensoren1, die DNA, RNA oder andere Nukleinsäuren als Sensorelement verwenden, in jüngster Zeit in den Fokus der biochemischen Sensoren der neuen Generation. Unter den funktionellen Nukleinsäuresensoren hat das DNA-Aptamer, also einzelsträngige DNA mit einer spezifischen Basensequenz, große Aufmerksamkeit erregt, da ein DNA-Aptamer mit hoher Bindungsselektivität spezifisch an eine Zielsubstanz bindet. Bisher wurden verschiedene Zielsubstanzen für DNA-Aptamer beschrieben, darunter biologische Substanzen wie der aus Blutplättchen gewonnene Wachstumsfaktor, Thrombin, Kokain und umwelttoxische Substanzen wie Ag+-Ionen, Hg2+-Ionen, Pb2+-Ionen und Sr2+-Ionen8,9. Darüber hinaus sind DNA-Aptamer stabile Materialien: Das DNA-Aptamer könnte über viele Zyklen thermisch denaturiert und renaturiert werden, ohne dass die Bindungsfähigkeit verloren geht1. Unter Ausnutzung dieser Eigenschaften wurden verschiedene Arten biochemischer DNA-Aptamer-Sensoren entwickelt9,10. Die meisten dieser biochemischen DNA-Aptamer-Sensoren verwenden Fluoreszenz-11,12, elektrochemische13,14 und Signale im sichtbaren Wellenlängenbereich15 als Ausgänge. Allerdings konnten diese biochemischen DNA-Aptamer-Sensoren ihre Zielmoleküle nur einmal messen, da diese Sensoren nicht die Funktion hatten, die Bindung der Zielmoleküle an das DNA-Aptamer aufzulösen. Für eine wiederholbare Messung des biochemischen DNA-Aptamer-Sensors ist es notwendig, den biochemischen DNA-Aptamer-Sensor durch Dissoziation und Entfernung des Zielmoleküls in den biochemischen DNA-Aptamer-Sensoren zu initialisieren.

Um diese Herausforderung zu meistern, schlagen wir einen wiederholbaren Nachweis von Ag+-Ionen mithilfe eines biochemischen DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogel-Sensors vor, der in ein mikrofluidisches Heizsystem integriert ist (Abb. 1a). Der vorgeschlagene biochemische Sensor wurde in drei Komponenten unterteilt: ein DNA-Aptamer-verknüpftes Hydrogel, eine Mikroheizung und einen Mikrokanal. Die DNA-Aptamere, die spezifisch an Ag+-Ionen binden,16,17 werden mit dem Acrylamid-Hydrogel-Polymernetzwerk vernetzt, um die Ag+-Ionen in eine Volumenänderung des Hydrogels umzuwandeln (Abb. 1b). Basierend auf früheren Untersuchungen17 kann die Sequenz des DNA-Aptamers ihre gerade Struktur in die Haarnadelstruktur ändern, wenn Ag + -Ionen an das DNA-Aptamer gebunden werden (Abb. 1c). Die Volumenänderung des DNA-Aptamer-gebundenen Hydrogels wird durch die Faltung des DNA-Aptamers durch Einfangen der Ag+-Ionen ausgelöst. Genauer gesagt werden die durch Silber vermittelten Basenpaare (C–Ag(I)–C) im DNA-Aptamer zwischen C-Resten gebildet und ändern ihre Struktur in die Haarnadelstruktur (Abb. 1c)17. Die Haarnadelstrukturen bewirken ein Ziehen des vernetzten Hydrogel-Polymernetzwerks, was zum Schrumpfen des DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogels führt. Für die wiederholbare Verwendung des geschrumpften DNA-Aptamer-gebundenen Hydrogels werden die an das DNA-Aptamer bindenden Ag+-Ionen durch Erhitzen und Spülen mit dem mikrofluidischen Heizgerät dissoziiert, wodurch das DNA-Aptamer-gebundene Hydrogel in den Ausgangszustand anschwillt. Mithilfe dieses Mechanismus könnte der vorgeschlagene biochemische DNA-Aptamer-verknüpfte Hydrogel-Sensor wiederholt Ag+-Ionen nachweisen, da die DNA-Aptamer im Hydrogel die Fähigkeit haben, das Ag+-Ion erneut einzufangen. In diesem Artikel untersuchen wir die Eigenschaften der Ag+-Ionen-Reaktivität des DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogels und charakterisieren die Heizleistung des mikrofluidischen Heizgeräts. Als Machbarkeitsnachweis demonstrieren wir schließlich die wiederholbare Ag+-Ionen-Erkennung durch den biochemischen DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogel-Sensor, der in das mikrofluidische Heizgerät integriert ist.

(a) Schematische Darstellung des biochemischen DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogel-Sensors, der in das mikrofluidische Heizgerät zur wiederholbaren Erkennung chemischer Substanzen integriert ist. (b) Das mit dem DNA-Aptamer verbundene Hydrogel verändert sein Volumen, indem es die Haarnadelstruktur des DNA-Aptamers bildet, die Ag+-Ionen einfängt. (c) Die Struktur des Ag-DNA-Aptamers ändert sich reversibel durch Bindung und Dissoziation der Ag+-Ionen.

Für den biochemischen DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogel-Sensor wurde Polyacrylamid als Polymernetzwerkmaterial zur Fixierung von DNA-Aptameren verwendet, da das Acrylamid-Hydrogel zwei Merkmale aufweist: Stabilität bei Umgebungstemperatur (4–100 °C)18 und keine Reaktion auf die Ag+-Ionen. Wir haben uns für Ag+-Ionen-DNA-Aptamer entschieden (Abb. 1c), da die Ag+-Ionen ein häufiger Indikator zur Untersuchung der Toxizität in der wässrigen Umgebung sind3. Die Enden des DNA-Aptamers wurden mit Methacrylsäure-N-Succinimidylester modifiziert, um eine Vernetzung mit dem Acrylamid-Netzwerk zu ermöglichen. Zur Herstellung des DNA-Aptamer-Sensors wird eine Vorgellösung (0,20 g/ml Acrylamid, 0,133 % (w/w) N,N'-Methylenbis(acrylamid) als Vernetzer, 0,5 % (v/v) Irgacure1173 als ein Photoinitiator und Ag+-Ionen-DNA-Aptamer (0, 40, 400 µM in der Vorgellösung) wurden in Poly-Dimethylsiloxan-Formen (PDMS) gegossen (Durchmesser: dm = 3 mm, Dicke: t = 0,5 mm oder Durchmesser). : dm = 2 mm, Dicke: t = 0,3 mm), anschließend durch UV-Bestrahlung vernetzt. Schließlich wurden die hergestellten DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogele drei Stunden lang in reines Wasser gegeben, um durch Absorption des umgebenden reinen Wassers zu quellen.

Zunächst haben wir das Schrumpfungsverhalten von DNA-Aptamer-gebundenem Hydrogel gegenüber Ag+-Ionen überprüft. Die Durchmesser des hergestellten DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogels, dgel, betrugen 4,6 mm, als wir die Form mit 3 mm Durchmesser verwendeten: dm = 3 mm und der Dicke: t = 0,5 mm (Abb. 2a links). Beim Eintauchen des DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogels in die CH3COOAg-Lösung zum Aufbringen der 10 mM Ag+-Ionen schrumpfte das DNA-Aptamer-verknüpfte Hydrogel (DNA-Aptamer: 400 µM in der Vorgellösung) erfolgreich (Abb. 2a rechts). Andererseits reagierte das reine Acrylamid-Hydrogel (kein DNA-Aptamer) auf keine Konzentration von Ag+-Ionen (Abb. 2b, weißes Quadrat). Diese Ergebnisse zeigten, dass das Schrumpfen des Hydrogels durch das DNA-Aptamer verursacht wurde. Daher wird auch davon ausgegangen, dass das DNA-Aptamer spezifisch an die Ag+-Ionen gebunden wurde und deren Struktur in die Haarnadelstruktur veränderte.

(a) Die Volumenänderung des DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogels bei Anwendung der 10 mM Ag+-Ionen. Der Maßstabsbalken beträgt 500 µm. (b) Die Beziehung zwischen dem Schrumpfungsverhältnis von DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogelen und den unterschiedlichen Ag+-Ionenkonzentrationen. (c) Die zeitliche Variation des Schrumpfungsverhältnisses ε bei unterschiedlichen Ag+-Ionenkonzentrationen. (d) Die zeitliche Variation des Schrumpfungsverhältnisses ε für die DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogele unterschiedlicher Größe. (e) Der Nachweis von Ag+-Ionen in den Umweltproben.

Zweitens wurde die angewendete Ag+-Ionenkonzentration von 10–5 bis 10 mM variiert, um den Einfluss der Ag+-Ionenkonzentration auf das Schrumpfungsverhältnis des DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogels zu beobachten. Das DNA-Aptamer-verknüpfte Hydrogel schrumpfte isotrop19. Das Schrumpfverhältnis ε wurde definiert als:

wobei A0 ein Bereich eines DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogels vor der Reaktion war und A(t) ein Bereich eines DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogels zum Reaktionszeitpunkt t war. Die Schrumpfungsverhältnisse der DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogele mit unterschiedlichen DNA-Aptamerdichten (40 µM und 400 µM DNA-Aptamer in den Vorgellösungen) nahmen mit steigender Ag+-Ionen-Konzentration zu (Abb. 2b, graues Quadrat und graues Dreieck). Das Hydrogel mit hochdichtem DNA-Aptamer (400 µM in Vorgellösung) veränderte sein Volumen stark (ε = 0,84 bei 10 mM Ag+-Ionen, Volumenänderungsverhältnis: 0,77) (Abb. 2b, graues Quadrat), während das Hydrogel mit DNA-Aptamer niedriger Dichte (40 µM in Vorgellösung) veränderten ihr Volumen leicht (ε = 0,95 bei 10 mM Ag+-Ionen, Volumenänderungsverhältnis: 0,93) (Abb. 2b, graues Dreieck). Diese Ergebnisse zeigten, dass das DNA-Aptamer-verknüpfte Hydrogel zur Messung der Konzentration von Ag+-Ionen eingesetzt werden konnte und die Empfindlichkeit des biochemischen Sensors des DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogels entsprechend der Menge an DNA-Aptamer im Hydrogel angepasst werden kann.

Anschließend untersuchten wir die Reaktionsgeschwindigkeit des DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogels aufgrund der Konzentration der aufgetragenen Ag+-Ionen (60 mM, 6 mM oder 0,6 mM). Das Volumen der DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogele änderte sich allmählich, wenn sowohl 60 mM Ag+-Ionen, 6 mM Ag+-Ionen als auch 0,6 mM Ag+-Ionen angewendet wurden, und die Volumenänderungen konvergierten innerhalb von ca. 1 Stunde (Abb. 2c, rotes Quadrat und blaues Quadrat, Film). 1). Unter Verwendung einer Datenanalysesoftware (IGOR Pro, WaveMetrics) wurden die aufgezeichneten Schrumpfungsverhältnisse ε durch eine Exponentialfunktion angenähert und eine Zeitkonstante der Exponentialfunktion τ zum Vergleich der Reaktionsgeschwindigkeit der DNA-Aptamer-verknüpften berechnet Hydrogel-Sensor. Die Zeitkonstanten τ betrugen ungefähr 16,3 min (60 mM Ag+-Ionen, Abb. 2c rotes Quadrat), 11,4 (6 mM Ag+-Ionen, Abb. 2c grünes Quadrat) und 18,6 min (0,6 mM Ag+-Ionen, Abb. 2c). . 2c blaues Quadrat), während die Schrumpfungsverhältnisse stark unterschiedlich waren (60 mM Ag+-Ionen: ε = 0,62, 6 mM Ag+-Ionen: ε = 0,68, 0,6 mM Ag+-Ionen: ε = 0,77). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Reaktionsgeschwindigkeit des DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogels nicht maßgeblich von der Ag+-Ionenkonzentration beeinflusst wurde.

Anschließend wurde der Einfluss des Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnisses (Rs,v) durch Änderung des Durchmessers von DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogelen beobachtet. DNA-Aptamer-verknüpfte Hydrogele mit unterschiedlichen Durchmessern (dgel = 2,7 mm und 4,6 mm) wurden mit unterschiedlich großen Formen (dm = 2 mm, t = 0,3 mm, Rs,v = 8,67 und dm = 3 mm, t = 0,5 mm) hergestellt , Rs,v = 5,33) und mit 10 mM Ag+-Ionen beaufschlagt. Die Durchmesser des DNA-Aptamer-gebundenen Hydrogels verringerten sich von 2,7 auf 2,5 mm (ε = 0,88, Abb. 2d blaues Quadrat) bzw. von 4,6 auf 4,2 mm (ε = 0,84, Abb. 2d rot). Die Zeitkonstante des kleineren DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogels (dgel = 2,7 mm, Rs,v = 8,67) war schneller (τ = 3,9 min) als die des größeren DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogels (dgel = 4,6 mm, Rs,v = 5,33). , τ = 19,0 min). Diese Ergebnisse zeigten, dass die Reaktionsgeschwindigkeit verbessert wird, indem das Verhältnis von Oberfläche zu Volumen des DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogels erhöht wird, ohne das Schrumpfungsverhältnis zu verringern.

Als nächstes wurde der Nachweis von Ag+-Ionen in den Umweltproben beobachtet. Die Umweltproben wurden aus einem Aquarium und einem Fluss entnommen (Hintergrundinformationen S1, Abb. S1). Die DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogele (400 µM DNA-Aptamer in den Vorgellösungen) wurden mit oder ohne zusätzliche 10 mM Ag+-Ionen über 2 Stunden in die Umweltproben eingetaucht. Das DNA-Aptamer-verknüpfte Hydrogel schrumpfte mit ε = 0,76 als Reaktion auf die Multiionen in der Probe des Aquariums (Abb. 2e, roter Rahmenbalken). Beim Eintauchen in die Probe des Aquariums mit 10 mM Ag+ schrumpfte das DNA-Aptamer-verknüpfte Hydrogel mit ε = 0,65 weitgehend (Abb. 2e, roter Balken). Ähnlich wie bei der Probe aus dem Aquarium schrumpfte das DNA-Aptamer-verknüpfte Hydrogel beim Eintauchen der Flussprobe in 10 mM Ag+-Ionen stark (Kontrolle: ε = 0,64, Probe mit 10 mM Ag+: ε = 0,59, Abb. 2e blau). Riegel). Diese Ergebnisse zeigten, dass das DNA-Aptamer-verknüpfte Hydrogel durch die Multiionen in der Umgebung beeinflusst wurde. Die in dieser Studie vorgeschlagenen DNA-Aptamer binden jedoch spezifisch Ag+-Ionen und bilden die Haarnadelstruktur, was zu einer starken Schrumpfung des DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogels führt (Hintergrundinformationen S2, Abb. S2)15. Tatsächlich gibt es einen deutlichen Unterschied in den Schrumpfungsverhältnissen des DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogels mit und ohne Ag+-Ionen. Daher kann der vorgeschlagene Sensor die Ag+-Ionen in der Umgebung erkennen, indem er den Unterschied im Schrumpfverhalten misst.

Die Dissoziationstemperatur von Ag+-Ionen aus DNA-Aptamer wird anhand der Schmelztemperatur Tm geschätzt. Das DNA-Aptamer verfügt über fünf AT-Basenpaare und fünf C-Ag(I)-C-Paare beim Einfangen von Ag+-Ionen. Bei der Wallace-Methode und früheren Untersuchungen16 steigt die Schmelztemperatur eines DNA-Duplex um 2 °C pro AT-Basenpaar (Tm, AT) und 8 °C pro C-Ag(I)-C-Paar (Tm, CAgC). jeweils. Daher könnte die Schmelztemperatur Tm berechnet werden als:

Um das DNA-Aptamer-verknüpfte Hydrogel auf die Schmelztemperatur zur Dissoziation der Ag+-Ionen zu erhitzen, haben wir das mikrofluidische Heizgerät hergestellt (Abb. 3a links). Das mikrofluidische Heizgerät ist in zwei Hauptkomponenten unterteilt: den Mikroheizer und den Mikrokanal. Der durch die strukturierte Au-Schicht (Dicke: ~ 175 nm, Breite: 1 mm, Abb. S3a) hergestellte Mikroheizer kann eine wässrige Lösung, die im Mikrokanal fließt, durch Joulesche Wärme erwärmen, die durch Anlegen von elektrischem Strom erzeugt wird (Abb. 3a rechts). Der Mikrokanal (Breite: 3 mm, Höhe: 1 mm) verfügt über eine Gelhaltekammer (Durchmesser: 7 mm, Höhe: 1,5 mm), um das DNA-Aptamer-gebundene Hydrogel im Fluss zu fixieren (Abb. S3b). Der Abstand vom Einlass zur Gelhaltekammer betrug 15 mm.

(a) Schematische Darstellung und Bilder des mikrofluidischen Heizgeräts zur Initialisierung des DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogels für den wiederholten Nachweis. Der Maßstabsbalken beträgt 1 mm. (b) Thermografisches Bild des mikrofluidischen Heizgeräts bei Zufuhr von DI-Wasser und Erwärmung durch den Mikroheizer. Der Maßstabsbalken beträgt 5 mm. (c) Die Beziehung zwischen der Entfernung vom Einlass und der Temperatur des Mikrokanals. Der Maßstabsbalken beträgt 5 mm. (d) Zeitverlaufstemperaturmessung der Gelhaltekammer. Der Maßstabsbalken beträgt 5 mm.

Anschließend wurden die Eigenschaften des hergestellten mikrofluidischen Heizgeräts untersucht. Das DI-Wasser wurde der Gelhaltekammer mit der Spritzenpumpe bei konstantem Durchfluss (5 µL/s) zugeführt und das zugeführte DI-Wasser wurde durch den Mikroheizer erhitzt (Strom: 0,35 A). Zu Beginn des Erhitzens (5 s) hatte die Oberseite der Gelkammer noch eine niedrige Temperatur (< 30 °C, Abb. 3b links). Nach 50 s langem Erhitzen des DI-Wassers wurde die Oberseite der Kammer erfolgreich auf über 50 °C erhitzt (Abb. 3b rechts). Durch Messung der Temperaturverteilung wurde die Temperatur des Mikrokanals vom Einlass zur Gelkammer allmählich erhöht und die Temperatur in der Gelhaltekammer erreichte ~ 70 °C (Abb. 3c). Darüber hinaus zeigte die Temperaturverlaufsmessung, dass die Temperatur an der Oberseite der Gelkammer in etwa 40 s 50 °C erreichte (Abb. 3d). Danach wurde die Temperatur in der Gelhaltekammer auf 70 °C angenähert. Diese Ergebnisse zeigten, dass das in der Gelkammer platzierte DNA-Aptamer-verknüpfte Hydrogel mithilfe der hergestellten mikrofluidischen Heizvorrichtung über die Schmelztemperatur des DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogels (Tm = 50 °C) erhitzt werden konnte.

Abschließend wurde der wiederholte Nachweis von Ag+-Ionen mit dem DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogel verifiziert. Das DNA-Aptamer-verknüpfte Hydrogel (400 µM) schrumpfte mit dem Schrumpfungsverhältnis ε = 0,74 bei der ersten Reaktion auf die 10 mM Ag+-Ionen (Abb. 4, blaues Diagramm). Anschließend wurden die eingefangenen Ag+-Ionen mit dem DNA-Aptamer-gebundenen Hydrogel durch Erhitzen und Spülen (Fluss von DI-Wasser: 1 µL/s, elektrischer Strom: 0,30 A) für 120 Minuten dissoziiert, um den Sensor zu initialisieren. Die angelegte Spannung wurde mit steigender Temperatur des Mikroheizers erhöht. Unter Verwendung des angelegten Stroms (0,30 A) und der Spannung nach der Konvergenz (6,9 V) wurde der Stromverbrauch des Mikrofluidikgeräts zu 2,07 W berechnet. Das initialisierte DNA-Aptamer-gebundene Hydrogel quoll auf und das Schrumpfungsverhältnis ε erholte sich auf 0,92 (Abb. 4, rotes Diagramm). Es wird angenommen, dass der Grund dafür, dass das DNA-Aptamer-verknüpfte Hydrogel nicht vollständig in den Ausgangszustand anschwoll, in der plastischen Verformung des Acrylamid-Hydrogel-Netzwerks liegt, die durch die Faltung des DNA-Aptamers verzögert wurde. Anschließend wurde das DNA-Aptamer-verknüpfte Hydrogel auf 10 mM Ag+-Ionen reagiert und durch wiederholtes Erhitzen und Spülen dissoziiert. Das Schrumpfungsverhältnis der zweiten und dritten Reaktion betrug ε = 0,74 und ε = 0,75 (Abb. 4, blaue Diagramme), was nahezu dem gleichen Wert wie die erste Reaktion entsprach, was zeigt, dass die Reaktionsfähigkeit des DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogels gleichmäßig erhalten blieb nach mehrmaligen Antworten. Bei der zweiten Initialisierung erholte sich auch das Schrumpfungsverhältnis des DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogels auf ε = 0,93, was ebenfalls dem gleichen Wert wie bei der ersten Initialisierung entsprach (Abb. 4 rote Diagramme). Daher zeigten diese Ergebnisse, dass unser vorgeschlagener biochemischer DNA-Aptamer-verknüpfter Hydrogel-Sensor, der in das mikrofluidische Heizgerät integriert ist, Ag+-Ionen wiederholt erkennen konnte.

Der wiederholbare Nachweis von Ag+-Ionen mithilfe des biochemischen DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogel-Sensors.

Unser vorgeschlagener DNA-Aptamer-verknüpfter Hydrogelsensor, der in das mikrofluidische Heizgerät integriert ist, zeigte die Fähigkeit der wiederholten Reaktion auf Ag+-Ionen. Dies ist das erste vorgeschlagene Konzept für wiederholbare Messungen von biochemischen DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogel-Sensoren durch Initialisierung mit Joule-Erwärmung. Silberionen sind schädlich für empfindliche Wasserorganismen: 1–5 µg/L Ag+-Ionen in einer wässrigen Umgebung töteten empfindliche Arten von Wasserorganismen, darunter repräsentative Insektenarten, Daphnien, Amphipoden, Forellen, Flundern und Haselnüsse; 100–401 µg/L Ag+-Ionen töteten verschiedene Meerestiere, darunter Jakobsmuscheln, Schnecken und Regenbogenforellen; 3000 µg/L Ag+-Ionen töteten Meeresbakterien3. Das Schrumpfverhalten des DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogels wurde durch die Multiionen in den Umgebungsproben leicht beeinflusst15,20,21. Es zeigte sich jedoch auch, dass das vorgeschlagene DNA-Aptamer-verknüpfte Hydrogel spezifisch an Ag+-Ionen bindet, was zu einer starken Schrumpfung führt. Das vorgeschlagene DNA-Aptamer-verknüpfte Hydrogel könnte die Ag+-Ionen in den Umgebungsproben durch Vergleich des Schrumpfungsverhaltens erkennen. Somit könnte der vorgeschlagene wiederholbare biochemische Sensor zur langfristigen Überwachung der Wasserqualität eingesetzt werden, die für die Verwirklichung einer nachhaltigen Gesellschaft erforderlich ist.

Die Initialisierung des vorgeschlagenen Sensors wurde durch einen geringen Stromverbrauch (ca. 2,07 W) nachgewiesen, der ein wirksames Merkmal für den Langzeitgebrauch ist. Was das Erfassungsziel des vorgeschlagenen Sensors betrifft, könnten aufgrund der Variation der DNA-Aptamersequenzen verschiedene Arten von Zielen akzeptabel sein8,9,22. Darüber hinaus könnten die Empfindlichkeit und die Reaktionsgeschwindigkeit des Sensors durch die Dichte des DNA-Aptamers im Hydrogel bzw. die Größe des gesamten Hydrogels entsprechend den Erfassungszielen abgestimmt werden.

Für den praktischen Einsatz des vorgeschlagenen DNA-Aptamer-gebundenen biochemischen Sensors ist ein automatisches Volumenmesssystem erforderlich, das den Durchmesser des Hydrogels im mikrofluidischen Heizgerät ermitteln kann, da die Volumenänderung des Hydrogels in diesem Artikel manuell gemessen wurde. Beispielsweise war ein CMOS-Bildsensor (Complementary Metal Oxide Semiconductor) ein attraktiver Kandidat, da der CMOS-Bildsensor stabil und kostengünstig ist und sich leicht an mikrofluidischen Geräten anbringen lässt, um den inneren Zustand des Geräts optisch zu überwachen23. Darüber hinaus könnte es von praktischem Nutzen sein, dass die Volumenänderung des DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogels in andere Informationen wie etwa eine sichtbare Farbänderung umgewandelt wird. Es wurde beispielsweise erwartet, dass ein photonischer Kolloidkristall, der die Volumenänderung in die sichtbare Wellenlängenänderung umwandeln kann, auch in das DNA-Aptamer-verknüpfte Hydrogel integriert wird, da der photonische Kolloidkristall im Hydrogel hergestellt werden kann15,21,24,25. Was die Erkennungsziele betrifft, kann das DNA-Aptamer-verknüpfte Hydrogel auf die anderen Ziele, einschließlich Schwermetallionen, reagieren, indem es das DNA-Aptamer verändert8,20,21. Da das Grundprinzip der Bindung des DNA-Aptamers an die Zielsubstanzen dasselbe ist, kann das Flashen mit den in dieser Studie vorgeschlagenen mikrofluidischen Heizgeräten auf andere DNA-Aptamer-gebundene Hydrogele angewendet werden. Die Schmelztemperatur Tm hängt von der Anzahl der gebundenen Basenpaare und der Bindungskraft zwischen den Zielsubstanzen und den Basenpaaren ab, kann aber wie in Gl. (2). Das vorgeschlagene mikrofluidische Heizgerät kann durch Einstellen des Stroms beliebige thermische Reize anwenden, sodass das DNA-Aptamer-verknüpfte Hydrogel mit verschiedenen DNA-Aptameren die Zielsubstanzen auch wiederholt erkennen könnte. Wir glauben, dass mit diesen Verbesserungen die wiederholte Erkennung chemischer Substanzen aus unserem Körper oder in der Umgebung mit unseren vorgeschlagenen DNA-Aptamer-basierten Hydrogel-Sensorsystemen vollständig automatisiert werden könnte.

Wir haben den wiederholbaren Nachweis von Ag+-Ionen mithilfe des biochemischen DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogel-Sensors vorgeschlagen, der in das mikrofluidische Heizsystem integriert ist. Der biochemische DNA-Aptamer-verknüpfte Hydrogelsensor kann den weiten Bereich von Ag+-Ionenkonzentrationen (10–5–10 mM) erfassen, einschließlich des toxischen Bereichs für verschiedene Wasserorganismen. Unser vorgeschlagener biochemischer DNA-Aptamer-gebundener Hydrogel-Sensor könnte die Ag+-Ionen dreimal nachweisen, indem er erhitzt und durch das mikrofluidische Heizgerät gespült wird. Das DNA-Aptamer-verknüpfte Hydrogel ist über einen weiten Temperaturbereich (4–100 °C) stabil, sodass unser vorgeschlagener biochemischer Sensor voraussichtlich für die Langzeitüberwachung mit hoher Stabilität der Umgebungstemperatur und geringem Stromverbrauch geeignet ist. In Zukunft erwarteten wir auch, dass unser vorgeschlagener biochemischer DNA-Aptamer-verknüpfter Hydrogel-Sensor durch Anpassung der DNA-Aptamer-Sequenz zur Erkennung verschiedener Ziele in unserem Körper oder in der Umgebung eingesetzt werden könnte.

Die Vorgellösung (0,20 g/ml Acrylamid (Wako, 012-00762) + 0,133 % (w/w) N,N'-Methylenbis(acrylamid) (Vernetzer, Wako, 018-03282) + 0,5 % ( v/v) Irgacure 1173 (Photoinitiator, BASF, 30472687) + Ag+-Ionen-DNA-Aptamer (Aptamersequenz: CH2=C(CH3)–C(=O)–NH-5′-CTCTCTTCTCAAA-AAACACAACACAC-3′-NH– C(=O)–C(CH3)=CH2, 0, 40, 400 µM in Vorgellösung, synthetisiert von Tsukuba Oligo Service) wurde zur Herstellung des DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogels verwendet. Die Vorgellösungen wurden hineingegossen eine PDMS-Form (Durchmesser: dm = 3 mm, Dicke: t = 0,5 mm oder Durchmesser: dm = 2 mm, Dicke: t = 0,3 mm, Basismaterial: Härter = 10:1, Toray, SILPOT 184) und das PDMS Die Form wurde mit Glasplatten (22 × 22 mm, Nr. 1, Matsunami) abgedeckt. Anschließend wurde die Vorgellösung in der PDMS-Form durch UV-Bestrahlung vernetzt. Um den Elektrolyten in der DNA-Lösung durch entionisiertes Wasser zu ersetzen Das hergestellte DNA-Aptamer-verknüpfte Hydrogel wurde 3 Stunden lang in 8 ml entionisiertes Wasser getaucht und dreimal gewaschen.

Das mikrofluidische Heizgerät wurde in den Mikroheizungsteil und den Mikrokanalteil unterteilt. Der Mikroheizerteil wurde nach dem folgenden Verfahren hergestellt (die Designdetails wurden in den Hintergrundinformationen beschrieben). Chrom- (Cr: ~ 5 nm) und Goldschichten (Au: ~ 175 nm) wurden mit einem Vakuumverdampfer (VE-2012, Vakuumgerät) als Haftschicht und einer Mikroheizung auf einem Glassubstrat (S9111, Matsunami) abgeschieden Drahtschicht bzw. Zur Mikrostrukturierung des Mikroheizungsmusters wurde das mit Cr/Au abgeschiedene Substrat 2 Minuten lang bei 100 °C vorgebacken und anschließend mit einem positiven Fotolack (OFPR-800-20CP, Tokyo ohka kogyo) aufgeschleudert 2000 U/min und dann 4 Min. bei 100 °C gebacken. Das UV-Licht wurde durch eine Fotomaske unter Verwendung eines Maskenausrichters (EMA-400, Union) auf das mit Fotolack beschichtete Substrat gestrahlt. Die Photoresistschicht wurde nach der UV-Bestrahlung mit NMD-3 (2,38 % Tetramethylammoniumhydroxid, Tokyo ohka kogyo) entwickelt und anschließend wurde der restliche Photoresist durch O2-Plasmaveraschung (SEDE-P, Meiwafosis) für 10 s entfernt. Das freigelegte Cr/Au wurde mit einem Au-Ätzmittel (0,2 M KI + 0,033 M Jodlösung; KI: 164-03972, Wako; Jodlösung: 094-01705, Wako) bzw. einem Cr-Ätzmittel (Kato Chemicals) geätzt. Nach zweimaligem Waschen mit entionisiertem Wasser wurde die Photoresistschicht mit Aceton (013-00356, Wako) entfernt, gefolgt von einer Spülung mit Ethanol (057-00456, Wako) und einer 30-sekündigen O2-Plasmareinigung. Zur Verkabelung mit dem Mikroheizungsteil wurden Cu-Drähte (2UEW0,26 mm, Kyowa Harmonet) über eine leitfähige Paste (No Solder, Elephantech) mit dem Au-Muster verbunden. Schließlich wurde ein Cytop (CTL-809 M, AGC Chemicals) zur Isolierung mit 1000 U/min auf das Au-geätzte Substrat aufgeschleudert und dann 2 Stunden lang bei 180 °C gebrannt.

Als nächstes wurde für die Mikrokanalherstellung (das detaillierte Design wurde in den Hintergrundinformationen beschrieben) das PDMS (Grundmaterial: Härter = 10:1) in eine Acrylform gegossen und durch zweistündiges Erhitzen auf 75 °C ausgehärtet . Der hergestellte Mikrokanalteil wurde auf dem Heizerteil platziert, nachdem ein Einlass durch eine Stanzbiopsie (ø1 mm, BP-10F, Kai Medical) geöffnet wurde. Der Einlass war über einen Tefzel-Schlauch (VICI, 1/16″ × 0,5 ETFE) mit einer Spritzenpumpe (KD Scientific, LEGATO 180) verbunden.

Das DNA-Aptamer-verknüpfte Hydrogel wurde mit einem inversen Phasenkontrastmikroskop (OLYMPUS, IX73P1-22FL/PH) beobachtet. Um die Reaktion auf Ag+-Ionen zu beobachten, wurde das DNA-Aptamer-verknüpfte Hydrogel 120 Minuten lang in 1 µM–10 mM Silberacetatlösungen (CH3COOAg) eingeweicht. Zum Vergleich der Reaktionsgeschwindigkeit wurden mithilfe einer Datenanalysesoftware (IGOR Pro, WaveMetrics) die aufgezeichneten Schrumpfungsverhältnisse ε durch eine Exponentialfunktion angenähert und eine Zeitkonstante der Exponentialfunktion, τ, zum Vergleich der Reaktionsgeschwindigkeit berechnet des DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogelsensors.

Zum Nachweis von Ag+-Ionen in den Umweltbedingungen wurden Umweltproben aus dem Aquarium und dem Fluss entnommen. Das DNA-Aptamer-verknüpfte Hydrogel (DNA-Aptamer: 400 µM in der Vorgellösung) wurde in die Umweltproben mit oder ohne 10 mM Ag+ eingetaucht.

Um die Mikroheizungsfunktion des mikrofluidischen Heizgeräts zu untersuchen, wurde über eine Stromquelle (PS40-20A, TEXIO) ein elektrischer Strom (0,35 A) an den Mikroheizungsteil angelegt. Das DI-Wasser wurde mit der Spritzenpumpe mit 5 µL/s in den Mikrokanalteil eingeleitet. Die Temperatur des Mikrokanals wurde mit einer Thermografiekamera (ETS320, FLIR) gemessen.

Für einen wiederholbaren Nachweis mit dem DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogel wurden die folgenden drei Prozesse dreimal wiederholt. Zunächst wurde das DNA-Aptamer-verknüpfte Hydrogel (DNA-Aptamer: 400 µM in der Vorgellösung) durch 120-minütiges Einweichen in 10 mM CH3COOAg-Lösung auf Ag+-Ionen reagiert. Dann wurde das DNA-Aptamer-verknüpfte Hydrogel erhitzt und durch das mikrofluidische Heizsystem (Fluss von DI-Wasser: 1 µL/s, elektrischer Strom: 0,30 A) 120 Minuten lang gespült, um Ag+-Ionen zu dissoziieren. Abschließend wurde das DNA-Aptamer-verknüpfte Hydrogel 120 Minuten lang in entionisiertem Wasser (20 °C) abgekühlt.

Liu, J., Cao, Z. & Lu, Y. Funktionelle Nukleinsäuresensoren. Chem. Rev. 109, 1948–1998 (2009).

Artikel CAS Google Scholar

Holz, JM Biologische Kreisläufe für toxische Elemente in der Umwelt. Science (80-) 183, 1049–1052 (1974).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Howe, PD & Dobson, S. Silber und Silberverbindungen: Umweltaspekte. Prägnante Int. Chem. Bewerten. Dok. https://doi.org/10.3109/19401736.2015.1046169 (2002).

Artikel Google Scholar

Lambeck, PV Integrierte optische Sensoren für den chemischen Bereich. Mess. Wissenschaft. Technol. 17, R93–R116 (2006).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Roh, S., Chung, T. & Lee, B. Überblick über die Eigenschaften mikro- und nanostrukturierter Oberflächenplasmonresonanzsensoren. Sensoren 11, 1565–1588 (2011).

Artikel ADS Google Scholar

Gao, W. et al. Vollständig integrierte tragbare Sensorarrays für die Multiplex-In-situ-Schweißanalyse. Natur 529, 509–514 (2016).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Yetisen, AK et al. Photonische Hydrogelsensoren. Biotechnologie. Adv. 34, 250–271 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Liu, J. Oligonukleotid-funktionalisierte Hydrogele als auf Reize reagierende Materialien und Biosensoren. Weiche Materie 7, 6757–6767 (2011).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Zhang, H., Zhou, L., Zhu, Z. & Yang, C. Jüngste Fortschritte bei Aptamer-basierten funktionellen Sonden für Bioanalyse und Biomedizin. Chem. Ein Eur. J. 22, 9886–9900 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Wang, Y. et al. So konstruieren Sie DNA-Hydrogele für Umweltanwendungen: Fortgeschrittene Wasseraufbereitung und Umweltanalyse. Klein 14, 1–19 (2018).

ADS Google Scholar

Li, T., Ackermann, D., Hall, AM & Famulok, M. Eingabeabhängige Induktion von Oligonukleotid-Strukturmotiven zur Durchführung molekularer Logik. Marmelade. Chem. Soc. 134, 3508–3516 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Shukoor, MI et al. Aptamer-Nanopartikel-Anordnung zur logikbasierten Erkennung. ACS-Appl. Mater. Schnittstellen 4, 3007–3011 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Zhou, M. & Dong, S. Bioelektrochemische Schnittstellentechnik: Auf dem Weg zur Herstellung elektrochemischer Biosensoren, Biobrennstoffzellen und autarker Logik-Biosensoren. Acc. Chem. Res. 44, 1232–1243 (2011).

Artikel CAS Google Scholar

Hayat, A. & Marty, JL Aptamer-basierte elektrochemische Sensoren für neu auftretende Umweltschadstoffe. Vorderseite. Chem. 2, 1–9 (2014).

Artikel ADS Google Scholar

Ye, B. et al. Kolorimetrische logische Reaktion basierend auf Aptamer-funktionalisierten kolloidalen Kristallhydrogelen. Nanoscale 7, 7565–7568 (2015).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Ono, A. et al. Spezifische Wechselwirkungen zwischen Silber(i)-Ionen und Cytosin-Cytosin-Paaren in DNA-Duplexen. Chem. Komm. https://doi.org/10.1039/b808686a (2008).

Artikel Google Scholar

Ono, A., Torigoe, H., Tanaka, Y. & Okamoto, I. Bindung von Metallionen durch Pyrimidinbasenpaare in DNA-Duplexen. Chem. Soc. Rev. 40, 5855–5866 (2011).

Artikel CAS Google Scholar

Mane, S., Ponrathnam, S. & Chavan, N. Einfluss der chemischen Vernetzung auf die Eigenschaften von Polymer-Mikrokügelchen: Eine Übersicht. Dürfen. Chem. Trans. 3, 473–485 (2016).

Google Scholar

Sennakesavan, G., Mostakhdemin, M., Dkhar, LK, Seyfoddin, A. & Fatihhi, SJ Hydrogele auf Acrylsäure-/Acrylamidbasis und ihre Eigenschaften – Eine Übersicht. Polym. Degrad. Stechen. 180, 109308 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Wang, C., Li, F., Bi, Y. & Guo, W. Reversible Modulation von 2D-Photonenkristallen mit einem responsiven Formgedächtnis-DNA-Hydrogelfilm. Adv. Mater. Schnittstellen 6, 1–8 (2019).

Artikel ADS Google Scholar

Ja, BF et al. Kolorimetrischer photonischer Hydrogel-Aptasensor zum Screening von Schwermetallionen. Nanoscale 4, 5998–6003 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Hermann, T. & Patel, DJ Adaptive Erkennung durch Nukleinsäureaptamere. Science (80-) 287, 820–825 (2000).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Tokuda, T. et al. CMOS-Bildsensor-basierter implantierbarer Glukosesensor mit auf Glukose reagierendem fluoreszierendem Hydrogel. Biomed. Opt. Express 5, 3859 (2014).

Artikel CAS Google Scholar

Tsuchiya, M., Kurashina, Y. & Onoe, H. Mit dem Auge erkennbare und wiederholbare biochemische flexible Sensoren unter Verwendung von photonischen kolloidalen Kristallhydrogel-Mikrokügelchen mit geringer Winkelabhängigkeit. Wissenschaft. Rep. 9, 1–10 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Ge, J. & Yin, Y. Responsive photonische Kristalle. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 1492–1522 (2011).

Artikel CAS Google Scholar

Referenzen herunterladen

Zuschuss für anspruchsvolle Forschung (Exploratory) (20K21828) und Zuschuss für anspruchsvolle Forschung (Pioneering) (21K18164) von der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS), Japan.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Koki Yoshida und Tomoki Hayashi.

Graduate School of Integrated Design Engineering, Keio University, 3-14-1 Hiyoshi, Kohoku-Ku, Yokohama, 223-8522, Japan

Koki Yoshida, Tomoki Hayashi und Hiroaki Onoe

Fakultät für Maschinenbau, Fakultät für Naturwissenschaften und Technologie, Keio-Universität, 3-14-1 Hiyoshi, Kohoku-Ku, Yokohama, 223-8522, Japan

Hiroaki Onoe

Abteilung für Informatik, School of Computing, Tokyo Institute of Technology, 4259 Nagatsutacho, Midori-Ku, Yokohama, 226-8502, Japan

Masahiro Takinoue

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

KY und TH trugen gleichermaßen bei. TH und HO haben die Studie entworfen. MT trägt zum Design und zur Modifikation von DNA-Aptamer bei. KY und TH führten die Experimente durch. KY und HO haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren haben die endgültige Fassung des Manuskripts genehmigt.

Korrespondenz mit Hiroaki Onoe.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Zusatzvideo 1.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Yoshida, K., Hayashi, T., Takinoue, M. et al. Wiederholbarer Nachweis von Ag+-Ionen mithilfe eines biochemischen DNA-Aptamer-verknüpften Hydrogel-Sensors, der in ein mikrofluidisches Heizsystem integriert ist. Sci Rep 12, 9692 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-13970-z

Zitat herunterladen

Eingegangen: 07. Dezember 2021

Angenommen: 31. Mai 2022

Veröffentlicht: 11. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-13970-z

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein gemeinsam nutzbarer Link verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.