Kortikale Gliazellen in SOD1(G93A)-Mäusen werden auf subtile Weise von ALS beeinflusst

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 6538 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Rolle der Glia bei der Amyotrophen Lateralsklerose (ALS) ist unbestreitbar. Ihre krankheitsbedingte Aktivität wurde im Rückenmark ausführlich untersucht, im Gehirn jedoch nur teilweise. Wir präsentieren hier eine umfassende Studie über Glia im Kortex von SOD1(G93A)-Mäusen – einem weit verbreiteten ALS-Modell. Mittels Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) und Immunhistochemie untersuchten wir Astrozyten, Mikroglia und Oligodendrozyten in vier Krankheitsstadien unter Berücksichtigung des Geschlechtsfaktors. Wir berichten über minimale Glia-Veränderungen während des Krankheitsverlaufs und unabhängig vom Geschlecht. Pseudobulk- und Einzelzellanalysen zeigten subtile krankheitsbedingte Transkriptionsveränderungen im Endstadium in Mikroglia und Oligodendrozyten, die durch Immunhistochemie gestützt wurden. Daher stützen unsere Daten die Hypothese, dass der SOD1(G93A)-Mauskortex die Krankheit bei Patienten nicht rekapituliert, und wir empfehlen die Verwendung eines anderen Modells für zukünftige Studien der kortikalen ALS-Pathologie.

Die charakteristische Degeneration der Motoneuronen (MNs) bei ALS führt zunächst zu einer fortschreitenden Muskelatrophie, die im Endstadium zu Schwierigkeiten beim Bewegen, Sprechen und Schlucken und Atemversagen führt. Generell gilt ALS als eine multifaktorielle Erkrankung mit kaum verstandenen pathologischen Mechanismen und einer mittleren Überlebenszeit von drei bis fünf Jahren. Derzeit gibt es keine Heilung oder Vorbeugung, sondern nur eine symptomatische Behandlung.

Obwohl MNs als primärer Zelltyp gelten, der von der Pathologie betroffen ist, haben mehrere Studien bestätigt, dass auch nicht-neuronale Zellen, einschließlich Gliazellen, Veränderungen erfahren und am Fortschreiten der ALS beteiligt sind1,2. Gliazellen reagieren mit verschiedenen Mechanismen auf Neurodegeneration oder Verletzungen. Mikroglia und Astrozyten erreichen einen sogenannten reaktiven Zustand, der durch Veränderungen der Genexpression und Morphologie gekennzeichnet ist. Durch die Aktivierung entzündlicher und entzündungshemmender Bahnen schützen sie das Gewebe vor weiteren Schäden. Im chronischen Krankheitsstadium wirken sie jedoch schädlich und tragen zum Fortschreiten der Neurodegeneration bei. Traditionell wurden reaktive Astrozyten und Mikroglia in die Subtypen A1 und A2 bzw. M1 und M2 unterteilt. Allerdings gilt diese Terminologie derzeit als veraltet, da in jüngster Zeit viele verschiedene Glia-Subpopulationen mit spezifischen Gensignaturen in verschiedenen Krankheitsmodellen beschrieben wurden3,4,5. Krankheitsassoziierte Astrozyten (DAA), krankheitsassoziierte Mikroglia (DAM), aktivierte Reaktionsmikroglia (ARM) und Interferonreaktionsmikroglia (IRM) sind nur einige Beispiele hierfür. Oligodendrozyten hingegen sind anfälliger für pathologische Veränderungen. Als Reaktion auf eine Krankheit neigen sie dazu, zu degenerieren, anstatt in einen reaktiven Zustand überzugehen. Ihre passive Rolle beim Fortschreiten der Krankheit wurde jedoch kürzlich durch Studien in Frage gestellt, die ihren Beitrag zum Immunschutz, zur Interferonsignalisierung sowie zur Antigenverarbeitung und -präsentation beschreiben6,7.

Über die Rolle von Astrozyten, Mikroglia und Oligodendrozyten und ihre jeweiligen pathologiebedingten Veränderungen wurde bei ALS-Patienten mehrfach berichtet8,9,10. Die meisten verfügbaren Daten stammen aus dem Rückenmark, einige Studien berichteten jedoch auch über Glia-Pathologien im Kortex11. Die bekannten pathologischen Veränderungen wurden größtenteils in postmortalem Gewebe identifiziert, was eine Untersuchung der Krankheitsmechanismen nicht ermöglicht, was den Bedarf an einem zuverlässigen Tiermodell erhöht. Derzeit stellt die SOD1(G93A)-Maus das am weitesten verbreitete Modell dar, das der familiären ALS12 ähnelt. Phänotypisch stimmt das Modell mit dem Krankheitsverlauf überein, und Studien im Rückenmark und Hirnstamm berichteten über ALS-bedingte Zellveränderungen, die zuvor bei Patienten festgestellt wurden2,8,13,14,15,16. Der Kortex scheint jedoch umstritten zu sein. Die Anzahl der Studien ist begrenzt und die Ergebnisse deuten auf widersprüchliche Ergebnisse hin. Während einige zeigen, dass kortikale Gliazellen und MNs vom ALS-ähnlichen Phänotyp betroffen sind17,18,19,20, berichten andere über keine Auswirkung im kortikalen Bereich im SOD1(G93A)-Modell21.

In dieser Studie wollten wir einen umfassenden Einblick in die SOD1-Glia-Pathologie im Kortex der SOD1(G93A)-Maus geben. Durch die Kombination robuster Hochdurchsatzmethoden wie scRNA-seq und Immunhistochemie analysierten wir Astrozyten, Mikroglia und Oligodendrozyten während des gesamten Krankheitsverlaufs, der durch Verhaltenstests charakterisiert wurde. Die scRNA-seq wurde verwendet, um Transkriptionsänderungen in einzelnen Gliazellen zeitlich zu überwachen und die Zusammensetzung verschiedener Gliapopulationen mit besonderem Schwerpunkt auf krankheitsassoziierten Subpopulationen zu untersuchen. Um die Charakterisierung der kortikalen Pathologie zu vervollständigen, haben wir die morphologischen und quantitativen Veränderungen von Gliazellen mithilfe der Immunhistochemie ausgewertet und kanonische Proteinmarker gemessen.

Für alle Experimente verwendeten wir transgene Mäuse, die hohe Mengen an menschlichem SOD1(G93A) (JAX-Stamm: 004435 C57BL/6 J-Tg (SOD1*G93A)1Gur/J) exprimierten, und ihre Wurfgeschwister, die keine Träger waren12. Dieser Stamm enthält ~ 25 Kopien des Transgens und seine 50 %ige Überlebenszeit beträgt 157 ± 9,3 Tage (https://www.jax.org/strain/004435). Alle Versuchsprotokolle wurden vom Tierpflegekomitee der Tschechischen Republik genehmigt (Genehmigungsnummer 40/2019). Alle Methoden unter Verwendung von Tieren wurden in Übereinstimmung mit der Richtlinie des Rates der Europäischen Gemeinschaften (86/609/EWG) durchgeführt. Alle für die Experimente verwendeten Tiere wurden mit Pentobarbital getötet und anschließend enthauptet. Aufgrund eines fortgeschrittenen Krankheitsstadiums wurden mutierte Mäuse kurz nach Erreichen des fünften Lebensmonats mit Kohlendioxid eingeschläfert. Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um sowohl das Leid als auch die Anzahl der eingesetzten Tiere zu minimieren. Die Studie wird gemäß den ARRIVE-Richtlinien berichtet.

Wir führten den Wire-Grid-Hang-Test und den Rota-Rod-Test (Mouse RotaRod NG 47650, Ugo Basile, Italien) durch, um Muskelkraft, -funktion und -koordination während der Krankheit zu beurteilen. Als zusätzlicher Parameter des Symptomverlaufs wurde auch das Gewicht gemessen. Der Test bestand aus einer einzigen wöchentlichen Sitzung mit drei Versuchen, beginnend bei P30, und dauerte 14 Wochen. Vor dem Experiment führten alle Tiere ein Training durch. Die Daten werden als Mittelwert oder Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) für n Tiere dargestellt. Zur Analyse der Unterschiede zwischen den Gruppen wurde eine Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen und der mehrfachen Vergleichskorrektur nach Holm-Sidak verwendet.

Die Maus wurde auf einen speziell angefertigten Drahtdeckel gelegt, etwa 60 cm über einem mit Holzspänen bedeckten Boden, und auf den Kopf gestellt. Die Sturzlatenz wurde gemessen. Zu Beginn eines Testzeitraums haben wir jede Maus mindestens 180 Sekunden lang dreimal hintereinander trainiert. In der Versuchssitzung hatte die Maus drei Versuche, sich am Deckel festzuhalten. Mit maximal 180 s haben wir von den dreien die beste Wertung notiert.

Die Maus wurde entgegen der Drehrichtung auf einem stationären Stab platziert. Der Stab begann sich mit einer konstanten Geschwindigkeit von 15 U/min zu drehen und die Latenzzeit bis zum Fallen wurde gemessen. Jede Maus wurde dreimal hintereinander mindestens 180 Sekunden lang bei einer Geschwindigkeit von 5, 10 und 15 U/min trainiert. In der Versuchssitzung hatte die Maus drei Versuche, auf der Stange zu bleiben. Mit maximal 180 s haben wir von den dreien die beste Wertung notiert.

Für immunhistochemische Analysen wurden die Tiere mit PTB (100 mg/kg, ip) tief anästhesiert, transkardial mit 20 ml Kochsalzlösung perfundiert, gefolgt von 20 ml gekühltem 4 % Paraformaldehyd (PFA) in 0,1 M Phosphatpuffer, und enthauptet. Das Gehirn und das Rückenmark wurden herauspräpariert, über Nacht mit PFA nachfixiert und zum Kryoschutz mit einem Saccharosegradienten (im Bereich von 10 bis 30 %) behandelt. Koronale 30 μm dicke Schnitte wurden mit einem Kryostat (Leica CM1850, Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) hergestellt.

Zur immunhistochemischen Färbung wurden die Schnitte in phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und anschließend die unspezifischen Bindungsstellen mit 5 % Chemiblocker (Millipore, Billerica, MA) und 0,2 % Triton in phosphatgepufferter Kochsalzlösung blockiert. Die Blockierungslösung wurde auch als Verdünnungsmittel für die Antiseren verwendet. Die Schnitte wurden mit den Primärantikörpern über Nacht inkubiert und die Sekundärantikörper wurden 2 Stunden lang bei 4–8 °C aufgetragen.

Die folgenden primären Antikörper wurden verwendet: Kaninchen-Anti-Aldehyd-Dehydrogenase-1-Familie, Mitglied L1 (ALDH1L1 1:500; Abcam, Cambridge, UK), Ratten-Anti-Myelin-Basisprotein (MBP, 1:500, Biorad, Hercules, CA, USA). ), Kaninchen-Anti-Cholin-Acetyltransferase (ChAT, 1:200, Merck, Darmstadt, Deutschland), Kaninchen-antiionisiertes Calcium-bindendes Adaptermolekül 1 (Iba-1, 1:500, Abcam, Cambridge, UK), gespaltene Kaninchen-Caspase -3 (CC3, 1:50, CellSignaling, Massachusetts, USA) und adenomatöse Polyposis coli (APC, 1:200, Merck, Darmstadt, Deutschland). Die Sekundärantikörper waren Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG oder Ziegen-Anti-Maus-IgG, konjugiert mit Alexa Fluor 488, und Hühner-Anti-Ratten-IgG, konjugiert mit Alexa Fluor 488 (1:500, Invitrogen, Waltham, MA, USA). Zellkerne wurden durch DAPI-Färbung (Merck, Darmstadt, Deutschland) sichtbar gemacht. Für die immunhistochemische Analyse wurde ein konfokales Zeiss LSM 880 Airyscan-Mikroskop mit Ar/HeNe-Lasern und 40-fachen Wasser- oder 63-fachen Ölobjektiven verwendet.

Alle Analysen wurden mit der FIJI-Bildverarbeitungssoftware (ImageJ 2.9.0/1.53t)22 durchgeführt. Konfokale Bilder (212 × 212 × 30 μm) wurden aus koronalen Schnitten des Gehirns (1 mm und 2 mm von Bregma) aufgenommen und deckten den Bereich des primären und sekundären motorischen und primären somatosensorischen Kortex ab (fünf bis sechs Zonen pro Hemisphäre).

Um die ALDH1L1-Fluoreszenzintensität zu quantifizieren, verwendeten wir sechs Tiere für jede Gruppe und zwei Schnitte von jedem Tier. Um den Hintergrund herauszufiltern, wurde die Schwellenwertmethode (Yen-Methode) verwendet. Wir haben für jedes Tier die mittlere integrierte Dichte berechnet, die auf den Schwellenwert begrenzt ist.

Um Veränderungen in der Morphologie von Mikroglia zu quantifizieren, führten wir eine Sholl-Analyse an IBA1-positiven Zellen mit dem Sholl-Analyse-Plugin23 durch. Wir verwendeten sechs Tiere für die Gruppe und zwei Gehirnschnitte von jedem Tier. Für jeden Hirnschnitt wurden mindestens acht Zellen analysiert. Für die Sholl-Analyse wurden die aufeinanderfolgenden Z-Stapelbilder in eine Projektion mit maximaler Intensität konvertiert und die Projektion wurde zur Erstellung einer Binärmaske mit einem Schwellenwert versehen. Wir haben die Anzahl der Schnittpunkte beginnend bei 5 μm vom Zentrum des Somas gezählt, mit einer Radiusschrittgröße von 5 μm.

Zur Quantifizierung der APC- und CC3-positiven Zellen wurden drei Tiere aus jeder Gruppe und ein Schnitt (1 mm von Bregma) von jedem Tier für die Analyse verwendet. Die Anzahl der APC- oder CC3-positiven Zellen wurde aus überlagerten Bildern bestimmt und als Prozentsatz der Marker-exprimierenden Zellen an der Gesamtzahl der DAPI+-Zellen ausgedrückt. Der Prozentsatz apoptotischer Zellen wurde dann als Verhältnis von CC3+ zu den zuvor gezählten APC+-Zellen ausgedrückt.

Für die Analyse der MBP-Färbung wurde ein konfokales Olympus FV10i-Mikroskop mit einem 60-fachen Ölobjektiv verwendet. Wir verwendeten sechs Tiere für jede Gruppe und zwei Schnitte für jedes Tier und scannten 12 Zonen pro Hemisphäre. Die MBP-Expressionsdichte wurde mithilfe eines speziell geschriebenen FIJI-Makros (ImageJ) bestimmt (verfügbar unter: https://github.com/jakubzahumensky/JT_paper). Kurz gesagt: Um die Dimensionalität der analysierten Bilder gleich zu halten, extrahierte das Makro einen Unterstapel der 20 hellsten Bilder aus jedem Z-Stapel. Anschließend wurde eine binäre Maske der Fasern in jedem Rahmen erstellt und der von der Maske abgedeckte Rahmenanteil gemessen. Innerhalb jedes Teilstapels wurde der Mittelwert dieses Wertes berechnet, was den von den Fasern eingenommenen Volumenanteil ergab. Die statistische Analyse der Unterschiede zwischen den Gruppen wurde mithilfe des ungepaarten T-Tests durchgeführt. Alle Fehlerbalken in Diagrammen stellen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dar.

Die Mäuse wurden mit Pentobarbital (PTB) (100 mg/kg, ip) tief anästhesiert und transkardial mit einem kalten (4–8 °C) Isolationspuffer perfundiert, der (in mM) enthielt: NaCl 136,0, KCl 5,4, HEPES 10,0, Glucose 5,5, Osmolalität 290 ± 3 mOsmol/kg. Wir isolierten den motorischen und primären somatosensorischen Kortex und folgten dem Dissoziationsprotokoll des erwachsenen Gehirns für Mäuse und Ratten (Milteyni-Biotec, Deutschland), ließen jedoch den Schritt der Entfernung roter Blutkörperchen aus. Um die Aktivierung von Immediate Early Genes (IEGs) zu verhindern, verwendeten wir den Transkriptionsinhibitor Actinomycin D (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 30 μM während der enzymatischen Dissoziation und 3 μM in den folgenden Schritten24. Nach der Trümmerentfernung wurden die Zellen auf 5 ml Ovomucoid-Inhibitorlösung (Worthington, NJ) geschichtet und durch Zentrifugation (300 × g für 6 Minuten) geerntet. Potenzielle Zellaggregate wurden durch 70-μm-Zellsiebe (Becton Dickinson, NJ) entfernt. Wir markierten die endgültige Suspension mit ACSA-2-, Cd11b- und O4-Antikörpern, die mit Allophycocyanin bzw. Phycoerythrin konjugiert waren (4 °C, 10 Minuten; Miltenyi-Biotec, Deutschland), um die Anreicherung von Astrozyten25, Mikroglia und Oligodendrozyten zu ermöglichen. Die Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie (FACS; BD Influx) angereichert und zum Sortieren von ACSA-2+-, Cd11b+- und O4+-Zellen kalibriert. Hoechst 33258 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) wurde zur Überprüfung der Lebensfähigkeit verwendet. Die Zellen wurden in 200 μl Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (ThermoFisher Scientific Waltham, MA), gesammelt. Für die Herstellung der Zellsuspension wurden vier Tiere pro Bedingung gepoolt. Nach der FACS wurde die Zellsuspension zentrifugiert, konzentriert und zur Bibliotheksvorbereitung verwendet.

Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1 (10 × Genomics, Pleasanton, CA) wurde zur Vorbereitung der Sequenzierungsbibliotheken verwendet und das Protokoll wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt wurde eine 10 × Chromium-Plattform verwendet, um einzelne Zellen zusammen mit Perlen, die mit zellspezifischen 10 × Barcodes, eindeutigen molekularen Identifikatoren (UMIs) und Poly(dT)-Sequenzen bedeckt waren, in Tröpfchen einzukapseln. Nach der umgekehrten Transkription wurden die cDNA-Bibliotheken amplifiziert (13–14 Zyklen), fragmentiert und an Sequenzierungsadapter ligiert. SPRISelect-Magnetkügelchen wurden zur Reinigung der cDNA-Suspension und zur Größenauswahl der Fragmente verwendet. Konzentration und Qualität der Bibliotheken wurden mit dem Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen) und dem Fragment Analyzer HS NGS Fragment Kit (#DNF-474, Agilent) gemessen. Die Bibliotheken wurden gepoolt und im Paired-End-Modus unter Verwendung des Illumina NovaSeq 6000 SP Reagent Kit sequenziert, wobei Read 1 einen Barcode und ein UMI enthielt und Read 2 die interessierende Sequenz abdeckte. Sequenzierungsdaten bestehend aus ca. 100–200 Millionen Lesevorgänge pro Probe (Supp. Tab. 4).

Die Sequenzierungsdaten wurden mit dem Referenzmausgenom GRCm38 abgeglichen und von STARsolo (STAR-Version 2.7.3a) mit Anmerkungen versehen (GENCODE-Version M8-Annotation)26. Die EmptyDrops-Funktion (DropletUtils R-Paket)27 mit einem Schwellenwert von 100 UMIs und FDR < = 0,001 wurde angewendet, um nur zellhaltige Tröpfchen zu erhalten. Die Zellen wurden anhand der für jedes Tröpfchen/jede Zelle spezifischen Barcodes gezählt. Die endgültige Anzahl der nachgewiesenen Zellen variierte zwischen den Proben und lag im Bereich von ca. von 2500 bis 6800 Zellen (Supp. Tab. 4).

Die Daten wurden mit dem Seurat R-Paket (Version 4.1.1)28 weiterverarbeitet. Zunächst wurden die Daten aller Proben SC-transformiert und integriert (mit Ausnahme der mitochondrialen und ribosomalen Gene, jeweils mit dem Präfix mt- bzw. Rps/Rpl). Mithilfe der Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) wurden 17 Hauptkomponenten (PC) visualisiert, die anschließend geclustert wurden (Funktionen FindNeighbors und FindClusters, UMAP-Auflösung 0,5). Cluster wurden basierend auf der Expression bekannter Markergene der erwarteten Zellpopulationen und ihrer Übereinstimmung mit den von der FindAllMarkers-Funktion gefundenen Markern annotiert (mindestens 80 % der Zellen im Cluster exprimierten die Marker). Das DoubletFinder29 R-Paket wurde zur Identifizierung von Tröpfchen verwendet, die möglicherweise mehr als eine Zelle enthalten. Die Dublettenbildungsrate wurde nach Schätzung von 10 × Genomics auf 3,9 % festgelegt und die Daten wurden gemäß den Empfehlungen der Autoren verarbeitet. Cluster, die mehrdeutige Marker ausdrücken und eine höhere Anzahl an Dubletts enthalten, wurden aus dem Datensatz herausgefiltert.

Das Geschlecht (männlich, weiblich) wurde einzelnen Zellen basierend auf der Expression von Genen zugeordnet, die durch das X- (Xist) und Y-Chromosom kodiert werden, und diejenigen, die nicht unseren Kriterien entsprachen (männlich: Anzahl von Xist > 0, nFeature_Y <2, nCount_Y <2; nFeature_Y ist eine Anzahl von Y-kodierten Genen und nCount_Y ist eine Anzahl von Transkripten, die dem Y-Chromosom zugeordnet sind) wurden aus dem Datensatz ausgeschlossen (Supp. Abb. 1a). Diese als „Undefiniert“ klassifizierten Zellen machten fast ein Drittel der Gesamtzahl der Zellen aus und stellten Zellen von geringer Qualität dar (Supp. Abb. 1b).

Ein spezifisches Genexpressionsprofil wurde auch verwendet, um eine Phase des Zellzyklus jeder Zelle zu bestimmen (CellCycleScoring Seurat-Funktion), um sicherzustellen, dass die Zellen in allen Phasen gleichmäßig auf die Cluster verteilt sind. Einzelne Zelltypen wurden basierend auf der Anzahl der erkannten Gene (nFeature_RNA), der Anzahl der Zählungen (nCount_RNA) und der Menge an mitochondrialer RNA (percent.mt) gefiltert. Die für jeden interessierenden Zelltyp spezifischen Grenzwerte waren die folgenden: Astrozyten – nFeature_RNA > 1000, 2000 < nCount_RNA < 10.000,cent.mt < 8; Mikroglia – nFeature_RNA > 700, 1000 < nCount_RNA < 10.000,cent.mt < 5; Oligodendrozyten – nFeature_RNA > 1300, 2500 < nCount_RNA < 50.000, percent.mt < 5 (Supp. Abb. 1d). Die Gewebedissoziation kann die Expression von IEGs induzieren, der ersten schnellen zellulären Reaktion auf Reize24,30. Ein Satz IEGs (z. B. Fos- und Jun-Transkriptionsfaktoren) wurde mithilfe der AddModuleScore-Funktion auf den UMAP projiziert, um den Grad der Induktion dieser Gene durch Probenvorbereitung zu untersuchen (Supp. Abb. 1c). Das SoupX R-Paket (Version 1.5.2)31 wurde verwendet, um den kontaminierenden RNA-Hintergrund zu entfernen. Als Eingabe wurden die ungefilterten und annotierten Daten bereitgestellt. Der Kontaminationsanteil wurde mit der automatisierten Methode geschätzt und lag für einzelne Proben im Bereich von 1 bis 2 %. Die Zählwerte wurden anschließend um die Kontamination korrigiert.

Um die Gesamtunterschiede zwischen Proben durch Pseudobulk-Hauptkomponentenanalyse (PCA) anzuzeigen, wurde der normalisierte und skalierte Datensatz verwendet, um Pseudobulk-Daten zu erstellen, indem die Genzahlen von Zellen derselben Erkrankung, desselben Alters und desselben Geschlechts summiert wurden.

Differenziell exprimierte Gene (DEGs) im Einzelzelldatensatz wurden durch t-Test in der FindMarkers-Funktion von Seurat identifiziert. In dieser Analyse wurden normalisierte und skalierte Daten im RNA-Assay verwendet. Der Schwellenwert für den P-angepassten Wert (padj) wurde auf 0,05 festgelegt, und Gene mit einer log2-fachen Änderung (log2FC) > 1 oder < – 1 wurden als differentiell exprimiert angesehen. Männer und Frauen wurden zu jedem Zeitpunkt für jeden Zelltyp und Zustand verglichen. Zu jedem Zeitpunkt und für jeden Zelltyp wurden auch Kontroll- (CTRL) und SOD1-Paare getestet (Endstadium-DEGs in Supp. Tab. 1). Die Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)32 wurde mit dem ClusterProfiler R-Paket (Version 4.0.5)33,34 durchgeführt. Die Größe des Referenzgensatzes war auf 10–800 Gene begrenzt und die Signifikanzschwelle wurde auf padj = 0,05 festgelegt. Als relevant wurden nur Ergebnisse angesehen, bei denen mehr als ein Gen zur Anreicherung (Kernanreicherung) beitrug.

Einzelne interessierende Zelltypen (Astrozyten, Mikroglia, Oligodendrozyten) wurden separat analysiert. Mitochondriale und ribosomale Gene wurden in den nachfolgenden Analysen nicht berücksichtigt. Die gefilterten, normalisierten, skalierten und SCtransformierten Daten wurden dann einer PCA unterzogen. Im Rahmen der Qualitätskontrolle wurden mehrere Gene ausgeschlossen, da sie zusätzliche unerwünschte Variabilität in der Clusterbildung einführten (Sod1, Gm8566, Cmss1, Cdk8 und lncRNAs Xist, Gm42418, Gm424181, Malat1). 16 PC für Mikroglia und Astrozyten und 17 PC für Oligodendrozyten wurden mit UMAP visualisiert und mit einer Auflösung von 0,2 geclustert (Funktionen FindNeighbors und FindClusters). Ein Cluster männlicher Kontrollzellen zum Zeitpunkt 3 M wurde aus den Astrozyten- und Oligodendrozyten-Untergruppen ausgeschlossen, da er potenziell stressbedingte Markergene (z. B. Cdkn1a, Fkbp5) exprimierte, die möglicherweise während der Probenvorbereitung induziert wurden (Supp. Abb. 2).

Marker der Subcluster wurden mithilfe des Standard-Wilcoxon-Tests in der FindAllMarkers-Funktion identifiziert (mindestens 10 % Zellen in einem Cluster exprimierten den angegebenen Marker, log2FC > 0,25, Supp. Tab. 3). Die Identität der Subcluster wurde durch Vergleich mit verfügbaren Gensignaturen verschiedener zuvor beschriebener zellulärer Subtypen mithilfe der AddModuleScore-Funktion und durch manuelle Annotation basierend auf den berechneten Markergenen bestimmt. Referenz-Genexpressionssignaturen wurden von Habib et al.5 (Gfap-Low- und Gfap-High-Astrozyten), Sala Frigerio et al.4 (ARM, IRM) und Marques et al.35 (MFOL1/2, MOL2, MOL5/6) entnommen ). Der Zwischenzustand von Astrozyten wurde mithilfe eines Gensatzes visualisiert, der berechnete Marker von Cluster 2 und Marker des Übergangszustands enthielt, die von Habib et al.5 veröffentlicht wurden. Die Signatur homöostatischer Mikroglia resultierte aus der Kombination homöostatischer Marker, die in Keren-Shaul et al.3, Mathys et al.36 und Butovsky und Weiner37 erwähnt wurden. Die 30 besten Gene wurden für die Projektion in Astrozyten verwendet, und 20 Gene wurden in den Mikroglia und Oligodendrozyten verwendet. Die Anzahl der Zellen, die in die Differentialexpressionsanalyse (DEA) und die Subpopulationsanalyse eintreten, ist in Supp angegeben. Tab. 4.

Zunächst untersuchten wir die erwarteten krankheitsbedingten phänotypischen Veränderungen, die für das in dieser Studie verwendete Tiermodell charakteristisch sind. Unser Ziel war es, die wichtigsten Wendepunkte der Krankheit zu ermitteln und ihren Verlauf zu charakterisieren.

Um den Phänotyp zu untersuchen, verwendeten wir zwei Arten von Verhaltenstests – den Drahtgitter-Hängetest und den Rotarod-Leistungstest. Wir testeten vergleichbare Gruppen von Tieren mit der SOD1(G93A)-Mutation (SOD1) und Kontrolltieren (CTRL) mit einer geraden Anzahl männlicher und weiblicher Tiere in jeder Gruppe. Zu Beginn des Testzeitraums (1 Monat) erbrachten alle Tiere in beiden Tests die maximale Zeit (180 s) (siehe Abschnitt „Methoden“). Die Unterschiede zwischen CTRL- und SOD1-Tieren machten sich erstmals beim Wire-Grid-Hang-Test bemerkbar, bei dem vor allem die Muskelkraft getestet wird (Abb. 1a). Die Unterschiede wurden im Alter von zwei Monaten signifikant, sodass wir diesen Punkt als Beginn betrachteten. Anschließend nahm die Leistung langsam ab, bis sie nach drei Monaten plötzlich abfiel und den Beginn des symptomatischen Stadiums anzeigte. Dieses Stadium, das mit einem noch weiteren Leistungsabfall einherging, dauerte etwa einen Monat, danach erreichten die Tiere das Endstadium, das durch eine schwerwiegende Beeinträchtigung der motorischen Funktionen gekennzeichnet war. Die mit dem Rotarod gemessene Abnahme der motorischen Koordination der Tiere (Abb. 1c) war nur im Endstadium signifikant.

Die Bewertung der kortikalen Pathologie durch Verhaltenstests und Immunhistochemie. (a) Der Hängedrahttest bestätigte den Rückgang der motorischen Fähigkeiten bei SOD1-Tieren während der Progression im Vergleich zu den CTRLs. (b) Die Ergebnisse des Hängedrahttests beim Vergleich von SOD1-Tieren, aufgeteilt nach Geschlecht, zeigten phänotypische Unterschiede im Krankheitsbeginn. (c), (d) Die Rotarod-Ergebnisse beim Vergleich der CTRL- und SOD1-Tiere zeigten keine signifikanten Veränderungen im Verlauf. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe einer Zwei-Wege-ANOVA mit dem Post-hoc-Test nach Holm-Sidak bestimmt, wobei die Fehlerbalken SEM darstellen. *padj ≤ 0,05, **padj ≤ 0,01, ***padj ≤ 0,001. n gibt die Anzahl der Leistungstiere an.

Bei der Untersuchung der männlichen und weiblichen SOD1-Leistung zeigte der Wire-Grid-Hang-Test Unterschiede im Symptombeginn und im Verlauf im Allgemeinen (Abb. 1b). Bei Männern trat der Krankheitsbeginn früher auf, und insgesamt schnitten sie schlechter ab als die Frauen, was mit der menschlichen Pathologie übereinstimmt38. Trotz des späteren Beginns nahm die Leistung der Frauen im symptomatischen Stadium jedoch schneller ab als die der Männer, was im Endstadium zu ähnlichen Ergebnissen für beide Geschlechter führte. Die Rotarod-Messungen ergaben keine signifikanten geschlechtsspezifischen Unterschiede in der motorischen Koordination während der Progression.

So bestätigten Verhaltenstests die charakteristischen Merkmale des Modells, identifizierten geschlechtsspezifische Unterschiede und bestimmten die vier Hauptzeitpunkte der Erkrankung, die wir in den folgenden Experimenten berücksichtigten.

Das scRNA-seq-Experiment war wie folgt konzipiert (Abb. 2a): CTRL- und SOD1-Mäuse wurden zu vier Zeitpunkten getötet, die die Hauptstadien der Krankheit darstellten, wobei zu jedem Zeitpunkt zwei Männchen und zwei Weibchen pro Bedingung verwendet wurden. Alle Zellsuspensionen wurden aus motorischem und somatosensorischem Kortikalisgewebe hergestellt und mithilfe von FACS auf drei Gliazelltypen – Astrozyten, Mikroglia und Oligodendrozyten – angereichert.

Übersicht über das Einzelzell-RNA-Sequenzierungsexperiment. (a) Ein Schema, das den Ablauf des Sequenzierungsexperiments zusammenfasst. (Erstellt mit BioRender.com) (b) Eine UMAP-Plotvisualisierung der identifizierten Zellcluster, die Zellen aus allen Proben enthält. ASTRO n = 5536, MG n = 8429, OLIGO n = 6180, PVM n = 434, OPC n = 165, COP n = 98, PERI n = 395, ENDO n = 235, ENDO/PERI n = 108, insgesamt n = 21.580. (c) Eine Visualisierung der Cluster-Repräsentation und der Prävalenz gezielter Glia bei beiden Erkrankungen und Geschlechtern. CTRL n = 7646, SOD1 n = 12.499, weiblich n = 10.246, männlich n = 9899. (d) Eine Liste kanonischer Markergene, die zur Identifizierung von Zellclustern verwendet werden. ASTRO – Astrozyten, MG – Mikroglia, PVM – perivaskuläre Makrophagen, OPC – Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, COP – gebundene Oligodendrozyten-Vorläufer, OLIGO – Oligodendrozyten, PERI – Perizyten, ENDO – Endothelzellen.

Die scRNA-seq-Daten folgten einer anfänglichen Qualitätskontrolle, Filterung und Clusterung, und der resultierende Satz einzelner Zellen wurde mithilfe der Expression kanonischer Markergene einzelner Gliazellpopulationen annotiert (Abb. 2b, d). Wie erwartet wurden die zahlreichsten Cluster im Datensatz als Astrozyten (Aqp4, Aldh1l1, Gjb6), Mikroglia (Cx3cr1, Aif1) und Oligodendrozyten (Mobp, Apod) identifiziert. Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) und gebundene Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (COP) gruppierten sich getrennt von den reifen Oligodendrozyten, die im Datensatz vorherrschten. Die Markergene dieser Populationen überlappten sich teilweise, was auf eine allmähliche Reifung von OPCs zu Oligodendrozyten hindeutet (Emid1, Pdgfra, Sox6, Vcan, Plp1, Cldn11 und andere). Darüber hinaus waren in der Minderheit perivaskuläre Makrophagen, Perizyten und Endothelzellen vorhanden.

Jeder Zelle wurde eine Geschlechtsidentität basierend auf der Expression von X- und Y-Chromosomen-assoziierten Genen zugewiesen. Zellen, die die Kriterien zur Geschlechtsbestimmung nicht erfüllten (siehe Methoden, Supp. Abb. 1a, b), wurden von weiteren Analysen ausgeschlossen. Kein Zellcluster war spezifisch in CTRL oder SOD1 oder in den männlichen oder weiblichen Proben überrepräsentiert, was die Robustheit der Zellvorbereitung bestätigt (Abb. 2c). Darüber hinaus bestätigten der geringe Anteil mitochondrialer Lesevorgänge und die minimale Aktivierung unmittelbar früher Gene die Datenqualität weiter (Supp. Abb. 1c, d). Insgesamt konnten wir die Zielzellpopulationen im Datensatz erfolgreich identifizieren und deren gleiche Anteile bei beiden Erkrankungen und Geschlechtern beobachten.

Um einen allgemeinen Überblick über die Veränderungen der Genexpression bei SOD1-Mäusen zu erhalten, wurde jeder der Hauptzelltypen als Pseudobulk einer PCA unterzogen (Abb. 3a). Die Analyse ergab eine geringfügige Veränderung zwischen den CTRL- und SOD1-Proben bei beiden Geschlechtern während des Krankheitsverlaufs. Die erste offensichtliche Verschiebung zwischen den Proben trat im Alter von vier Monaten bei Mikroglia und Oligodendrozyten auf, was darauf hindeutet, dass sie auf eine ALS-ähnliche Pathologie reagieren. Die SOD1-Astrozyten, von denen häufig berichtet wird, dass sie in SOD1(G93A) und anderen Modellen von ALS14,18,19,39 aktiviert werden, blieben unverändert und gruppierten sich mit den CTRL-Proben. Bemerkenswerterweise zeigte die Clusterbildung eine Verschiebung der drei Monate alten (3 Mio.) männlichen Datenpunkte. Dies war am deutlichsten bei Astrozyten zu beobachten, wo es die größte Variabilitätsquelle darstellte (was sich in der Trennung in PCA1 widerspiegelte). Bei der Untersuchung der Ursache der Variabilität identifizierten wir einen kleinen Zellcluster in Astrozyten und Oligodendrozyten, der nur bei 3 M CTRL-Männern vorhanden war (Supp. Abb. 2). Der Cluster war durch die Expression der stressbezogenen Gene Cdkn1a und Fkbp5 gekennzeichnet, die in der Pseudobulk-Analyse die extremsten Belastungswerte in den jeweiligen Hauptkomponenten (PCs) aufwiesen, was die Wirkung des Clusters auf die Verdrängung von 3 M CTRL-Männchen bestätigte Datenpunkte. Da das Vorhandensein des Clusters einen vernachlässigbaren Einfluss auf die weitere Analyse hatte, betrachteten wir ihn als technisches Artefakt der Probenverarbeitung und entfernten ihn aus dem Datensatz. Dieses Ergebnis zeigte jedoch, dass die Einzelzellanalyse in der Lage ist, selbst geringfügige Veränderungen in Zellsubpopulationen zu charakterisieren, die sonst in der herkömmlichen Massenanalyse möglicherweise schwer zu interpretieren wären.

Pseudobulk- und differentielle Expressionsanalysen zeigen nur geringfügige Veränderungen in der Genexpression. (a) Pseudobulk-PCA-Cluster-Vergleich männlicher und weiblicher Proben, der eine gemeinsame Reaktion auf die anhaltende Pathologie in Mikroglia und Oligodendrozyten bei 4 M zeigt. (b) Eine Visualisierung der wenigen unterschiedlich exprimierten Gene, die bei Männern und Frauen in allen Zelltypen als fehlreguliert befunden wurden 4 M Zeitpunkt. Xist unterscheidet deutlich weibliche Zellen, während Eif2s3y und Uty beide vom männlichen Chromosom Y exprimiert werden. (c) Ergebnisse der DEA beim Vergleich von CTRL- und SOD1 4 M-Proben zeigen eine begrenzte Anzahl hoch- und herunterregulierter Gene im Endstadium. (d) Anreicherungskurven, die die Ergebnisse der GSEA bei 4 M visualisieren. Ein Referenzgensatz wurde unter in Oligodendrozyten herunterregulierten Genen angereichert. Die Analyse der GO-Begriffe zeigte, dass mitochondriale Komponenten unter den in Oligodendrozyten und Mikroglia hochregulierten Genen angereichert sind.

Basierend auf den geschlechtsspezifischen Unterschieden in Verhaltenstests (Abb. 1a – d) untersuchten wir die potenziellen ALS-assoziierten Genexpressionsvariationen zwischen den Geschlechtern durch DEA ​​und verglichen die männlichen und weiblichen Zellen getrennt für CTRL und SOD1. Die Analyse ergab nur wenige DEGs basierend auf den festgelegten Schwellenwerten von |log2FC|> 1 und padj < 0,05. Das X-Chromosom-Gen Xist war bei den Weibchen in allen drei Zelltypen unabhängig vom Genotyp signifikant hochreguliert. Das Xist-Gen spielt eine wichtige Rolle bei der Kompensation der Gendosis bei Frauen, indem es eines der X-Chromosomen zum Schweigen bringt, und wird daher nur in weiblichen Zellen exprimiert40. Zwei vom Chromosom Y kodierte Gene (Eif2s3y, Uty) waren bei Männern hochreguliert, der Unterschied in ihrer Expression überschritt jedoch nur in Astrozyten den log2FC-Schwellenwert (Abb. 3b). Abgesehen davon wurden in unseren Daten keine anderen dysregulierten Gene gefunden, die mit dem Fortschreiten der Pathologie und dem Geschlecht zusammenhängen.

Um krankheitsbedingte Transkriptionsänderungen zu untersuchen, führten wir die DEA anhand der Vergleiche von CTRL- und SOD1-Proben zu jedem Zeitpunkt und für jeden Zelltyp durch, wobei wir Männer und Frauen zusammen betrachteten. Das Sod1-Gen war das einzige, das DEG in allen gemessenen Stadien der Krankheit, einschließlich des Endstadiums, signifikant hochregulierte, wie in Abb. 3c und Supp gezeigt. Tab. 1 (|log2FC|> 1, padj < 0,05), was die Gültigkeit des SOD1(G93A)-Modells bestätigt. Andere fehlregulierte Gene waren meist nichtkodierende oder ribosomale Transkripte, die sich der Qualitätskontrolle entzogen. Darüber hinaus waren die 4 M CTRL-Proben durch eine erhöhte Expression der Gene Cdk8 und Cmss1 über alle Zelltypen hinweg gekennzeichnet. Diese beiden Gene wurden in der anschließenden Analyse als Störfaktoren identifiziert, die sich negativ auf die Subclustering-Ergebnisse auswirken (Supp. Abb. 2a, b). Daher wurden sie als voreingenommene Faktoren ohne Zusammenhang mit der ALS-ähnlichen Pathologie angesehen. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse unabhängig vom Geschlecht eine minimale Variation der Genexpression im Zusammenhang mit dem Fortschreiten der Pathologie im Kortex der SOD1(G93A)-Maus, was auf subtile Veränderungen in Mikroglia und Oligodendrozyten in der Spätphase der Krankheit hinweist.

Um die potenzielle biologische Bedeutung der durch DEA ​​festgestellten minimalen Veränderungen der Genexpression zu untersuchen, verwendeten wir den GSEA32, der sich auf den am stärksten betroffenen 4 M-Zeitpunkt konzentrierte. Da GSEA die Expression aller Gene berücksichtigt, unabhängig von Grenzwerten bei log2FC oder p-Wert, ermöglicht es das Auffinden jeglicher fehlregulierter Prozesse, selbst wenn die Veränderung der einzelnen Gene geringfügig ist.

Zunächst verwendeten wir einen Metaanalyse-Ansatz und sammelten die Gensignaturen von Gliazellen, die von der SOD1-Mutation betroffen waren, aus 15 transkriptomischen Studien, die in den letzten 20 Jahren veröffentlicht wurden (Supp. Tab. 2). Dieser Satz enthält Daten, die größtenteils aus dem Rückenmark des SOD1(G93A)-Modells stammen. Mithilfe von GSEA konnten wir die Anreicherung nur eines einzigen Gensatzes nachweisen, der kürzlich von Liu et al.15 in Hirnstamm-Oligodendrozyten von 100 Tage alten Mäusen herunterreguliert wurde. Übereinstimmend zeigten unsere Ergebnisse eine negative Anreicherung der Oligodendrozyten (NES = – 1,32, padj = 6,3 × 10– 3; NES – normalisierter Anreicherungsscore; Abb. 3d), was auf kleine, aber signifikante Veränderungen in den kortikalen 4 M SOD1-Oligodendrozyten hinweist. Es wurde kein mit Mikroglia oder Astrozyten angereicherter Gensatz gefunden.

Zusätzlich zur Metaanalyse suchten wir auch nach in unseren Daten angereicherten Begriffen der Gene Ontology (GO) 41,42. Es stellte sich heraus, dass zwei aktivierte Begriffe im Zusammenhang mit Mitochondrien in unserem Datensatz hochreguliert waren: Mitochondrienhülle in Oligodendrozyten (NES = 1,11, padj = 8,2 × 10–3) und mitochondrialer proteinhaltiger Komplex in Mikroglia (NES = 1,73, padj = 1,1 ×). 10–6) (Abb. 3d). Zur Untermauerung unserer Daten wurde die mitochondriale Dysfunktion ausführlich als einer der Faktoren diskutiert, die zur ALS-Pathologie beitragen, nicht nur in Bezug auf das mutierte Sod1-Gen, sondern auch auf andere ALS-bedingte genetische Störungen (Übersicht bei Jankovic et al.43). .

Insgesamt konnten wir trotz der geringen Anzahl an DEGs subtile Veränderungen in der Mitochondrienfunktion in kortikalen Oligodendrozyten und Mikroglia feststellen. Angesichts der Anzahl der angereicherten Begriffe und ihrer Bedeutung ist die Schwere der Funktionsstörung jedoch eher gering.

Da die Pseudobulk-Analysen nur geringfügige Variationen in der Genexpression der kortikalen SOD1(G93A)-Glia aufdeckten, spekulierten wir, dass die pathologischen Veränderungen durch einen kleinen Teil der Zellen repräsentiert werden könnten, der auf Populationsebene verborgen ist. Daher führten wir eine eingehende Subclustering-Analyse mit dem Ziel durch, Subpopulationen zu identifizieren, die möglicherweise eine Rolle beim Fortschreiten der Krankheit spielen.

Beginnend mit Astrozyten identifizierten wir drei Cluster, die sowohl in den CTRL- als auch in den SOD1-Proben in einem ähnlichen Verhältnis vorhanden waren (Abb. 4a). Um diese Cluster zu kommentieren, berechneten wir ihre Markergene (Supp. Tab. 3) und visualisierten die Gensignaturen der von Habib et al.5 beschriebenen Astrozyten-Subtypen in einem Mausmodell der Alzheimer-Krankheit (AD). Die Studie identifizierte zwei ähnliche Subpopulationen von Astrozyten, die Reaktivitätsmarker exprimieren – Gfap-High und DAAs. Während Gfap-high in Kontrollen und AD-Proben vorhanden war, kamen DAAs nur im AD-Modell vor, und die Autoren vermuteten, dass sie möglicherweise eine Rolle beim Fortschreiten der Krankheit spielen. Die Markergene von Cluster 3 in unseren Daten überlappten teilweise mit den Markern des Gfap-High-Clusters (z. B. die Gene Mt1, Mt2, Id3, Cd9, Vim), wir konnten die DAAs jedoch nicht spezifisch in SOD1-Proben nachweisen. Bemerkenswert ist, dass die Expressionsniveaus von Gfap und Vim niedrig waren, was auf eine begrenzte pathologische Reaktion der Astrozyten im Kortex der mutierten SOD1(G93A)-Mäuse schließen lässt. Dieser Befund stimmt mit den Ergebnissen der Pseudobulk-Analyse überein und zeigt keine Veränderungen in den Astrozyten. Cluster 1 teilte gemeinsame Gene mit Gfap-niedrigen Astrozyten (z. B. Luzp2, Trpm3), und der verbleibende Cluster 2 exprimierte Marker sowohl von Gfap-High- als auch von Gfap-Low-Clustern und stellte daher einen Cluster im Zwischenzustand dar.

Die Subpopulationsanalyse ergab eine einzigartige Subpopulation von Oligodendrozyten in SOD1-Proben. UMAP-Visualisierung von Subpopulationen von Astrozyten (n = 5292) (a), Mikroglia (n = 8414) (b) und Oligodendrozyten (n = 5876) (c), aufgeteilt in CTRL- und SOD1-Zustand (links), einschließlich Zellen aus allen vier Zeitpunkte. Genexpressionssignaturen zuvor beschriebener Subpopulationen werden auf UMAP projiziert (Mitte oben). Eine Liste repräsentativer Cluster-Marker, die für ihre Annotation verwendet werden (Mitte unten). Anteile der Subpopulationen in CTRL und SOD1 (rechts), einschließlich Zellen aus allen vier Zeitpunkten. (d) UMAP-Visualisierung von CTRL- und SOD1-Oligodendrozyten, aufgeteilt nach Alter (1 M: n = 682, 2 M: n = 1697, 3 M: n = 1430, 4 M: n = 2067). Das Balkendiagramm zeigt die Anteile der Teilpopulationen zu jedem Zeitpunkt.

Mikroglia wurden in vier Cluster gruppiert, wie im UMAP-Diagramm in Abb. 4b gezeigt. Cluster 1 war durch die Expression homöostatischer Marker3,36,37 gekennzeichnet. Die Gensignaturen der Mikroglia in den Clustern 2 und 3 ähnelten dem Expressionsprofil von ARM, das in einem AD-Modell beschrieben wurde, aber auch in einem geringeren Anteil in einem gesunden Gehirn3,4. Diese aktivierten Mikroglia regulieren charakteristischerweise homöostatische Gene wie Cx3cr1, P2ry12 und Sall1 herunter, was auch in unseren Daten erkennbar ist (Abb. 4b). Darüber hinaus war Cluster 3 durch eine höhere Expression von Apoe gekennzeichnet, einem Hauptregulator des mikroglialen neurodegenerativen Phänotyps44. Cluster 4 stellte IRM4 dar und war durch die Expression von Ifit2, Ifit3 und Ifitm3, den Genen, die am Interferon-Reaktionsweg beteiligt sind, klar unterscheidbar. Allerdings war der IRM-Anteil in beiden Fällen sehr gering. Dennoch stellten wir in SOD1-Proben (Cluster 2) einen geringen Anstieg der Subpopulation aktivierter Mikroglia fest, was auf eine beginnende Aktivierung von Mikroglia als Reaktion auf pathologische Reize schließen lässt.

Oligodendrozyten bildeten vier Cluster (Abb. 4c). Cluster 1 hatte eine ähnliche Genexpressionssignatur wie die von Marques et al.35 beschriebenen myelinbildenden Oligodendrozyten (MFOL), einschließlich der Expression der Gene Mal, Plp1, Mog und Opalin. Diese Zellen waren überwiegend zum Zeitpunkt von einem Monat (1 M) vorhanden (Abb. 4d), was mit der ausgedehnten Myelinisierung bei Nagetieren in den ersten Wochen nach der Geburt übereinstimmt. Cluster 2 stellt reife Oligodendrozyten (MOL2) dar, die Klk6 exprimieren, aber auch den reifen Oligodendrozyten-Marker Apod und die für myelinisierende Zellen typischen Gene Pmp22, S100b und Apc7,35,46. Floriddia et al.7 berichteten, dass die MOL2-Population in der weißen Substanz des Rückenmarks häufiger vorkommt, in geringerem Maße jedoch auch im Kortex35. Die Anteile unter beiden Bedingungen waren für die Cluster 1 und 2 ähnlich. Die Cluster 3 und 4 zeigten eine erhöhte Expression mehrerer Gene, die in reifen Oligodendrozytenpopulationen MOL5/67,35 gefunden wurden. Interessanterweise war Cluster 4 fast ausschließlich in den SOD1-Proben vorhanden (Abb. 4d) und zeichnete sich durch eine höhere Expression von Apoe und Il33 aus. Il33 ist in Oligodendrozyten und Astrozyten in Läsionen hochreguliert und kann von gestressten oder beschädigten Zellen freigesetzt werden. Es hat eine entzündungshemmende Wirkung und fördert die Aktivierung von Mikroglia (Übersicht bei Sun et al.47). Über eine Hochregulierung von Ill33 wurde bereits in krankheitsassoziierten Oligodendrozyten in einem Mausmodell von AD48,49 berichtet. Apoe wurde als Markergen der Immun-Oligodendroglia (ImOLG)50 identifiziert, die in Multiple-Sklerose-Läsionen angereichert waren, was auf ihre Rolle bei chronischer Demyelinisierung und kontinuierlichen Versuchen zur Remyelinisierung schließen lässt51. Daher nehmen wir an, dass Cluster 4 einen beschädigten oder reaktiven Zustand von Oligodendrozyten darstellt, die auf die pathologischen Reize im 4 M SOD1-Kortex reagieren. Es ist verlockend zu spekulieren, ob der geringe Anstieg der Anzahl aktivierter Mikroglia und möglicherweise die Verschiebung in den Zwischenzustand der Astrozyten, die wir im SOD1 beobachteten (Abb. 4a bzw. b), eine Reaktion auf die beschädigten/aktivierten Oligodendrozyten sein könnten. Eine solche Interaktion zwischen krankheitsassoziierten Zuständen von Gliazellen wurde kürzlich bei AD52 und auch bei ALS2 beschrieben.

Insgesamt konnten wir mehrere Subpopulationen von Astrozyten, Mikroglia und Oligodendrozyten identifizieren und die Genexpressionsmuster spezifischer, zuvor beschriebener zellulärer Subtypen erkennen. Entgegen unseren Erwartungen konnten wir in den SOD1-Proben jedoch außer den beschädigten/aktivierten Oligodendrozyten keine krankheitsassoziierten Subpopulationen nachweisen.

Die Ergebnisse der scRNA-seq-Analyse deuteten auf geringfügige Veränderungen in der kortikalen Glia des SOD1(G93A)-Mausmodells hin. Um diese Schlussfolgerung weiter zu untersuchen und zu bestätigen, führten wir eine immunhistochemische Analyse der Glia im motorischen und primären somatosensorischen Kortex (der identischen Region, die für die Sequenzierung verwendet wurde) zum Zeitpunkt 4 M durch, wenn die phänotypischen Veränderungen am ausgeprägtesten waren. Die abgebildeten Zonen innerhalb der interessierenden Bereiche sind in Abb. 5a dargestellt. Da die morphologischen Veränderungen im Rückenmark gut beschrieben sind, haben wir im Endstadium (4 M) auch den Lendenbereich des Rückenmarks gefärbt und diese Bilder als Referenz für fortgeschrittene Gliose bei unseren Tieren verwendet.

Die Immunhistochemie (a) Ein oberer Cartoon zeigt 12 Bereiche, die zur Untersuchung morphologischer Veränderungen und zur Quantifizierung von APC und CC3 gescannt wurden. Der untere Cartoon zeigt 24 Bereiche, die für die MBP-Analyse gescannt wurden. (b) Die Fluoreszenzanalyse ergab keine signifikanten Unterschiede in der Morphologie zwischen kortikalen Astrozyten bei SOD1- (n = 6) und CTRL-Tieren (n = 6). (c) Repräsentative Bilder der ALDH1L1-Färbung im Kortex und im Rückenmark im Vergleich zu Astrozyten zeigen einen morphologischen Unterschied zwischen SOD1 und CTRL im Rückenmark, aber keinen erkennbaren Unterschied im Kortex. (d) Die Ergebnisse der Sholl-Analyse zeigten eine sehr ähnliche Mikroglia-Komplexität sowohl in CTRL- (n = 6) als auch in SOD1-Proben (n = 6). Scholl-Masken mit roten konzentrischen Radien zeigen einzelne Mikroglia mit Schwellenwert, wie sie für die Analyse verwendet wurden. (e) Repräsentative Bilder von kortikalen und spinalen Schnitten, die mit IBA1 gefärbt wurden, zeigen eine offensichtliche amöbische Morphologie der spinalen Mikroglia, aber nur subtile morphologische Veränderungen, die durch bauchige Termini (siehe Nahaufnahme) in der Kortikalis dargestellt werden. (f) Die Quantifizierung von MBP im Kortex ergab einen unbedeutenden Unterschied zwischen SOD1 (n = 6) und CTRLs (n = 6). Die Anzahl der APC+-Zellen war zwischen SOD1 (n = 3) und CTRLs (n = 3) konsistent und die Anzahl der APC+-Zellen, die zusammen mit CC3 gefärbt wurden und als Marker für Apoptose in Oligodendrozyten verwendet wurden, blieb ebenfalls ähnlich, was darauf hindeutet, dass kein Oligodendrozyten erkennbar ist Degenerationen. (g) Repräsentative Bilder von MBP-, APC- und CC3-Färbungsskalenbalken, 20 μm. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des ungepaarten T-Tests bestimmt. Fehlerbalken stellen SEM dar. n gibt die Anzahl der eingesetzten Tiere an.

Astrozyten wurden mit dem ALDH1L1-Marker gefärbt, was die Untersuchung der gesamten Zellmorphologie einschließlich der Prozesse ermöglichte. Astrogliose, eine morphologische Veränderung, die durch eine Vergrößerung des Zellkörpers und verkürzte, verdickte Prozesse gekennzeichnet ist, ist eine charakteristische Reaktion von Astrozyten in pathologischen Zuständen und wurde im ALS-Rückenmark gut beschrieben13,14. Im Kortex führten wir eine Fluoreszenzanalyse durch, um morphologische Unterschiede festzustellen (Abb. 5b). Die Analyse zeigte jedoch sehr ähnliche Fluoreszenzwerte sowohl der SOD1- als auch der CTRL-Astrozyten, was darauf hindeutet, dass mit der Aktivierung keine Zellvergrößerung verbunden ist. Die ähnliche Morphologie ist in Abb. 5c im Vergleich zu Astrozyten in den ventralen Hörnern der Lendenwirbelsäule zu sehen, die einen vergrößerten Körper mit deutlich verkürzten Fortsätzen zeigten. Die Ergebnisse der Fluoreszenzanalyse stimmen mit der Feststellung geringer oder keiner Veränderung in Astrozyten auf der Ebene der Genexpression überein.

Mikroglia verändern wie Astrozyten ihre Morphologie als Reaktion auf pathologische Reize. Sie ziehen Prozesse zurück und nehmen eine bestimmte Amöbenform an, die typisch für ihren aktivierten Zustand ist. Um Mikroglia sichtbar zu machen, verwendeten wir den IBA1-Antikörper und färbten zum Vergleich sowohl die Kortikalis als auch das Lendenwirbelsäulenmark. Die Sholl-Analyse, die wir zur Bewertung der Veränderungen in der Morphologie verwendet haben (Abb. 5d), wird häufig durchgeführt, um die Komplexität der Zellarborisierung zu quantifizieren. Die Analyse bestätigte, dass sich die Morphologie der kortikalen SOD1-Mikroglia nicht wesentlich von der der CTRL-Tiere unterscheidet. Wir haben keine kürzeren Prozesse oder eine verringerte Verzweigung festgestellt, was auf einen aktivierten Phänotyp hindeuten würde. Bei der Analyse bemerkten wir jedoch, dass einige Spitzen der Fortsätze bauchig und vergrößert aussahen (Abb. 5e). Diese als Bulbustermini bezeichneten Strukturen erscheinen als erste Reaktion der Mikroglia nach einer Verletzung53 und können eine erste Phase der Mikroglia-Aktivierung darstellen, die in den transkriptomischen Daten beobachtet wird. Die SOD1-Mikroglia in den ventralen Hörnern des Rückenmarks weisen dagegen die typische Amöbenform mit sehr kurzen und verdickten Fortsätzen auf, die mit der Aktivierung einhergehen.

Die vorherige Analyse identifizierte einen SOD1-spezifischen Oligodendrozyten-Cluster (Cluster 4), was darauf hindeutet, dass ein bestimmter Teil der Zellen apoptotisch ist. Wir haben uns daher auf die Proteinexpressionsänderungen im Zusammenhang mit chronischer Demyelinisierung, Nekrose oder Apoptose konzentriert. Dementsprechend färbten wir auf Myelin-Basisprotein (MBP) – einen Marker für die Myelinisierung, auf adenomatöse Polyposis coli (APC) – einen Marker für adulte Oligodendrozyten, und auf gespaltene Caspase 3 (CC3) – einen apoptotischen Marker. Die Quantifizierung der MBP-Signalintensität sowie der Anzahl der APC + -Oligodendrozyten im Kortex der SOD1-Tiere schloss die Demyelinisierungsprozesse aus, da im Vergleich zu den CTRLs keine signifikante Abnahme der MBP- oder APC + -Zellen auftrat (Abb. 5f). In ähnlicher Weise ergab die gleichzeitige Färbung von CC3 mit APC weder in SOD1 noch in CTRLs eine unterschiedliche Häufigkeit von CC3 + -Oligodendrozyten, was auf eine ähnliche Apoptoserate schließen lässt (Abb. 5f). Die MBP-Färbung und das repräsentative Bild einer für APC und CC3 positiven Zelle sind in Abb. 5g zu finden. Insgesamt zeigten die Daten keine signifikante Demyelinisierung oder Degeneration von Oligodendrozyten, daher ist es wahrscheinlich, dass der in scRNA-seq bei 4 M Tieren identifizierte SOD1-spezifische Cluster 4 keine sterbenden oder beschädigten Zellen darstellt.

Insgesamt konnten wir keine tiefgreifenden morphologischen Veränderungen in der kortikalen Glia der SOD1-Mäuse feststellen. Oligodendrozyten zeigten keinen erhöhten Zelltod oder Verlust des MBP-Proteins, was darauf hindeutet, dass seine Funktion im Kortex der ALS-Mäuse erhalten bleibt.

ALS ist eine verheerende neurodegenerative Erkrankung mit schnellem Fortschreiten und ohne wirksame Behandlungsstrategien. Obwohl es sich in erster Linie um eine Motoneuron-Erkrankung handelt, tragen auch andere Zelltypen, einschließlich Gliazellen, zum Fortschreiten der Krankheit bei und stellen daher ein potenzielles Ziel für zukünftige Therapien dar. In der Vergangenheit wurden mehrere experimentelle Modelle entwickelt, um die Mechanismen der Krankheit zu verstehen und die Suche nach therapeutischen Zielen zu erleichtern. Unter ihnen nimmt das SOD1(G93A)-Mausmodell den Spitzenplatz als am besten charakterisierter Mausstamm ein, der in der aktuellen ALS-Forschung verwendet wird. Trotz der langfristigen Anwendung ist die Auswirkung der pathologischen Veränderungen auf verschiedene ZNS-Regionen noch nicht vollständig geklärt.

Der pathologische Effekt auf den Kortex ist aufgrund seiner Rolle bei der Planung, Kontrolle und Ausführung willkürlicher Bewegungen, die bei ALS stark beeinträchtigt sind, von besonderem Interesse. Pathologische Veränderungen im Kortex von ALS-Patienten wurden seit der Erstbeschreibung der Krankheit im Jahr 1869 berichtet, und die Überwachung kortikaler Strukturanomalien wurde zu einem Standardverfahren für die ALS-Diagnose54. Zusammen mit dem kortikalen MN-Tod wurden auch Veränderungen in der Glia beobachtet, einschließlich Mikrogliose11,55,56,57, begleitet von der DAM-ähnlichen Genexpressionssignatur56, Demyelinisierung8 und einer Änderung der Oligodendrozytenfunktion von myelinisierend zu neurounterstützend57.

Während die Veränderungen beim Menschen gut dokumentiert sind, ist über die Auswirkungen der ALS-ähnlichen Pathologie auf den Kortex der SOD1-Modelle weniger bekannt. Im SOD1(G93A)-Modell wurde die kortikale MN-Degeneration von Özdinler et al.17 und anderen zusammen mit den Veränderungen in der Glia früh beobachtet18,19,20. Es wurde gezeigt, dass sich reaktive Astrozyten im SOD1(G93A)-Kortex von ihren Gegenstücken in der Wirbelsäule unterscheiden, aber dennoch eine toxische Wirkung auf Neuronen haben18,19,58. Gomes et al.19 berichteten jedoch auch über keine signifikanten Veränderungen der Genexpression in Mikroglia oder Oligodendrozyten. Darüber hinaus schlugen andere vor, dass die Pathologie im SOD1-Modell nur auf spinale und Bulbar-Motoneuronen beschränkt sei und den motorischen Kortex nicht beeinträchtige21. Solche gegensätzlichen Daten werfen daher die Frage auf, inwieweit der Kortex im SOD1-Mausmodell betroffen ist und wie gut dieses Modell die kortikale Pathologie beim Menschen abbildet.

Um diese Wissenslücke zu schließen, verwendeten wir Einzelzell-RNA-Sequenzierung mit Unterstützung der Immunhistochemie, um Genexpressionsänderungen, das Vorhandensein krankheitsassoziierter Zellpopulationen und morphologische oder andere pathologische Veränderungen in kortikalen Gliazellen zu erkennen, die mit der ALS-ähnlichen Pathologie im SOD1 einhergehen( G93A) Mausmodell. Der ALS-ähnliche Phänotyp wurde durch Verhaltenstests bestätigt, einschließlich geschlechtsabhängiger Unterschiede im Krankheitsverlauf, wie von McCombe und Henderson38 berichtet. Die Ergebnisse der auf Glia konzentrierten scRNA-seq zeigten geringfügige Veränderungen bei Mikroglia und Oligodendrozyten und zeigten keine signifikante ALS-bedingte Verschiebung bei Astrozyten, was im Widerspruch zu mehreren Studien steht, die über den reaktiven Phänotyp von Astrozyten berichten18,19,58. Obwohl Sod1 das einzige signifikant fehlregulierte Gen im SOD1(G93A)-Modell war, deutete GSEA auf eine mitochondriale Dysfunktion in Mikroglia und Oligodendrozyten hin. Ähnliche Veränderungen wurden kürzlich von Liu et al.15 in den Oligodendrozyten beobachtet, die aus dem Hirnstamm 100 Tage alter SOD1-Mäuse isoliert wurden, was auf eine mögliche Fehlregulation der Energiebahnen schließen lässt.

Da unsere Daten im motorischen und primären somatosensorischen Kortex generiert wurden, der eine Endpunktregion des von ALS betroffenen Kortikospinaltrakts darstellt, ermöglichen sie die Beantwortung grundlegender Fragen zum Ursprungsort und zur Richtung des Fortschreitens der ALS. Derzeit gibt es zwei Hypothesen, die beide durch Belege gestützt werden (Übersicht bei van den Bos et al.59). Die Hypothese des „Sterbens nach vorne“ legt nahe, dass ALS seinen Ursprung im Kortex hat und sich in Richtung der spinalen MNs ausbreitet. Andererseits geht die Hypothese des „Rücksterbens“ davon aus, dass ALS in den Muskeln oder neuromuskulären Verbindungen beginnt. In Anbetracht des fortgeschrittenen ALS-ähnlichen Phänotyps der SOD1-Mäuse im Endstadium und der ausgeprägteren Veränderungen im Hirnstamm und im Rückenmark, die anderswo beobachtet wurden, sprechen die milderen Veränderungen im Kortex, die unsere Daten zeigen, eher für die Hypothese des „Rücksterbens“. in SOD1(G93A)-Mäusen. Interessanterweise steht dies im Gegensatz zu einem Bericht von Burg et al.60, der den Kortex als Ausgangspunkt von ALS bei SOD1(G86R)-Mäusen angibt. Die widersprüchlichen Daten könnten auf eine unterschiedliche Wirkung spezifischer Punktmutationen auf den Charakter der Krankheit hinweisen, was weitere Untersuchungen erfordert.

Viele der früheren Berichte, die die Auswirkungen der SOD1-Mutation auf den motorischen Kortex untersuchten, stützten sich auf die Messung der begrenzten Anzahl von Genen und Proteinen19,20,55 oder auf die Analyse der Massenpopulation von Zellen18,61. Dies verringerte folglich die Sensitivität der Analyse und schränkte die Interpretierbarkeit der Daten ein. In dieser Studie verwendeten wir scRNA-seq mit hohem Durchsatz, was eine eingehende Analyse kleiner Zellpopulationen ermöglichte, die durch Massenansätze nicht unterschieden werden können. Mithilfe von scRNA-seq konnten in jüngsten wegweisenden Studien verschiedene krankheitsassoziierte Glia-Populationen entdeckt werden, die eine wichtige Rolle beim Fortschreiten der Krankheit spielen3,4,5,6. Interessanterweise kommen viele dieser Populationen bei mehreren Krankheiten vor, was auf gemeinsame Mechanismen schließen lässt, die Gliazellen als Reaktion auf pathologische Reize einsetzen. Beispielsweise wurde eine DAM-ähnliche Population nicht nur bei der Alzheimer-Krankheit, sondern auch im Rückenmark der SOD1(G93A)-Maus3 und in einem Rückenmarksverletzungsmodell62 identifiziert. In unserer Arbeit suchten wir erfolglos nach diesen Populationen, was die minimalen Veränderungen bestätigte, die sowohl auf der Ebene der Massentranskription als auch durch Immunhistochemie beobachtet wurden. Mit Ausnahme von Mikroglia und Oligodendrozyten fanden wir größtenteils eine ähnliche Zellzusammensetzung zwischen den Kontrolltieren und den SOD1(G93A)-Tieren. Im Fall der Mikroglia beobachteten wir einen leichten Anstieg des Anteils der aktivierten Mikroglia, was auf eine Anfangsphase ihrer Aktivierung schließen lässt. Die Daten wurden durch Immunhistochemie vervollständigt, wodurch knollige Enden an Mikrogliafortsätzen sichtbar wurden. Deutlichere Veränderungen wurden bei Oligodendrozyten beobachtet, wo die Subclustering-Analyse die Existenz einer einzigartigen Population von Oligodendrozyten identifizierte, die durch eine erhöhte Expression von Apoe und Il33 gekennzeichnet ist und speziell in 4 M SOD1-Proben angereichert ist. Da in der Immunhistochemie kein tiefgreifender Oligodendrozytenverlust oder eine höhere Apoptoserate vorliegt, könnten wir über die aktive Rolle dieser Oligodendrozytenpopulation beim Fortschreiten der Krankheit spekulieren. Dies steht auch im Einklang mit jüngsten Erkenntnissen, die auf eine aktive Rolle von Oligodendrozyten beim Fortschreiten der Multiplen Sklerose6 und bei der Alterung der weißen Substanz63 hinweisen, was im Gegensatz zu ihrer weithin akzeptierten passiven Rolle steht. Bemerkenswert ist, dass wir mit Ausnahme von Apoe oder Il33, die oben erwähnt wurden, keine ähnlichen Expressionsmuster wie zuvor berichtete krankheitsassoziierte Oligodendrozyten6,48,49,50 beobachteten. Dies könnte jedoch mit den insgesamt leichten Veränderungen der Genexpression zusammenhängen, die in unseren Daten beobachtet wurden.

Zusammenfassend zeigt unsere Studie, dass kortikale Gliazellen im SOD1(G93A)-Modell selbst im äußersten Endstadium der Erkrankung nur geringfügig betroffen sind. Darüber hinaus haben wir aufgrund der Leistungsfähigkeit von scRNA-seq gezeigt, dass Oligodendrozyten möglicherweise aktiv an der Pathologie beteiligt sind, und unterstreichen, wie wichtig es ist, ihre Rolle in weiteren Forschungen zu berücksichtigen. Abschließend schlagen wir aufgrund unserer Ergebnisse vor, dass das SOD1(G93A)-Mausmodell die menschliche Krankheit nicht vollständig wiedergibt, und empfehlen die Verwendung eines anderen Modellsystems zur Untersuchung der kortikalen ALS-Pathologie.

Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die ALS-ähnlichen pathologischen Veränderungen im sensomotorischen Kortex von SOD1(G93A)-Mäusen minimal sind. Auf diesem Gebiet gibt es eine anhaltende Diskussion darüber, ob das Modell die Krankheit einschließlich der im Kortex auftretenden Pathologie vollständig nachahmt, und die veröffentlichten Ergebnisse sind umstritten. Unsere gemeinsamen Ergebnisse der Untersuchung von Gliazellen auf mehreren Ebenen ergaben keine signifikanten Veränderungen der SOD1-Astrozyten und nur geringfügige Veränderungen der Mikroglia und Oligodendrozyten im Endstadium. Die Veränderungen von Mikroglia und Oligodendrozyten lassen auf eine beginnende Aktivierung im Zusammenhang mit der Pathologie schließen, das Ausmaß der Veränderung entspricht jedoch nicht der im menschlichen Gewebe beschriebenen Pathologie. Die im Endstadium identifizierten SOD1-spezifischen Oligodendrozyten tragen jedoch zu den kürzlich veröffentlichten Beweisen bei, die ihre aktive Rolle bei der Neurodegeneration belegen, und weisen weitgehend das lang anhaltende Dogma zurück, das Oligodendrozyten als ausschließlich passiv bei ZNS-Erkrankungen darstellt. Trotz der Anzeichen einer Aktivierung ist die Auswirkung der ALS-ähnlichen Pathologie auf die Gliazellen im Kortex von SOD1(G93A)-Mäusen jedoch gering und unsere Daten liefern stützende Beweise gegen die Verwendung dieses Modells zur Untersuchung der kortikalen Pathologie von ALS.

Die während dieser aktuellen Studie generierten scRNA-seq-Daten sind im Gene Expression Omnibus64 des NCBI verfügbar und über die GEO-Serien-Zugangsnummer GSE206330 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc) zugänglich =GSE206330).

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Die Autoren danken Helena Pavlikova und Marketa Hemerova für ihre hervorragende technische Unterstützung und Frances Zatrepalkova für das Korrekturlesen des Manuskripts. Diese Studie wurde durch die Zuschüsse 23-05327S und 19-02046S der Tschechischen Wissenschaftsstiftung, von der Charles University Grant Agency (Zuschussnummer 158320), von der Institutional Support RVO 86652036, von MEYS CR (CZ.1.05/1.1.00/) unterstützt. 02.0109), von der Tschechischen Akademie der Wissenschaften (Strategie AV21, Fördernummer VP29), vom Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union unter der EJP RD COFUND-EJP Nr. 825575 und von EU – Next Generation EU, LX22NPO5107 (MEYS). Die Mikroskopie wurde im Microscopy Service Center des Instituts für Experimentelle Medizin CAS mit Unterstützung des MEYS CR (LM2023050 Czech-Bioimaging) durchgeführt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Tereza Filipi und Zuzana Benesova.

Abteilung für Zelluläre Neurophysiologie, Institut für Experimentelle Medizin, Tschechische Akademie der Wissenschaften, Videnska 1083, 14220, Prag, Tschechische Republik

Tereza Filipi, Ondrej Vanatko, Jana Tureckova, Monika Kubiskova, Denisa Kirdajova und Miroslava Anderova

Zweite Medizinische Fakultät, Karlsuniversität, V Uvalu 84, 15006, Prag, Tschechische Republik

Tereza Filipi & Ondrej Vanatko

Labor für Genexpression, Institut für Biotechnologie CAS, BIOCEV, Prumyslova 595, 25250, Vestec, Tschechische Republik

Zuzana Matusova, Pavel Abaffy, Sarka Benesova und Lukas Valihrach

Fakultät für Naturwissenschaften, Karls-Universität, Albertov 6, 12800, Prag, Tschechische Republik

Zuzana Matusova

Fakultät für Informatik und Chemie, Fakultät für Chemische Technologie, Universität für Chemie und Technologie, Technicka 5, 16628, Prag, Tschechische Republik

Sarka Benesova

Abteilung für funktionelle Organisation von Biomembranen, Institut für experimentelle Medizin, Tschechische Akademie der Wissenschaften, Videnska 1083, 14220, Prag, Tschechische Republik

Jakub Zahumensky

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TF und ZM interpretierten die Daten, verfassten das Manuskript und erstellten alle Zahlen. TF, ZM, PA, OV, JT, MK und DK führten Experimente durch. TF, ZM, PA, LV, JT,. OV und SB analysierten die Daten. JZ hat ein Makro für die immunhistochemische Analyse geschrieben. MA und LV haben die Studie konzipiert und betreut. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft und bearbeitet.

Korrespondenz mit Lukas Valihrach oder Miroslava Anderova.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Filipi, T., Matusova, Z., Abaffy, P. et al. Kortikale Gliazellen in SOD1(G93A)-Mäusen werden auf subtile Weise von einer ALS-ähnlichen Pathologie beeinflusst. Sci Rep 13, 6538 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-33608-y

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Eingegangen: 25. Oktober 2022

Angenommen: 15. April 2023

Veröffentlicht: 21. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-33608-y

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