RhoA der glatten Gefäßmuskulatur wirkt der Bildung eines Bauchaortenaneurysmas entgegen, indem es die MAP4K4-Aktivität moduliert

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 1071 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Ob eine kleine GTPase RhoA eine Rolle bei der Pathologie des Bauchaortenaneurysmas (AAA) spielt, ist nicht geklärt. Wir zeigen hier, dass die RhoA-Expression in menschlichen AAA-Läsionen im Vergleich zu normalen Bereichen reduziert ist. Darüber hinaus ist die Inzidenz der AAA-Bildung bei vaskulären glatten Muskelzellen (VSMC)-spezifischen RhoA-Conditional-Knockout-Mäusen (cKO) erhöht. Die Kontraktilität der Aortenringe und VSMCs von RhoA-cKO-Mäusen ist verringert, und die Expression von Genen, die mit der VSMC-Kontraktilität zusammenhängen, wird durch den Verlust von RhoA abgeschwächt. RhoA-Depletion aktiviert die Signalübertragung der Mitogen-aktivierten Protein-Kinase (MAP), einschließlich MAP4K4, in der Aorta und den VSMCs. Die Hemmung der MAP4K4-Aktivität durch DMX-5804 verringert die AAA-Bildung. Set, ein Bindungsprotein für aktives RhoA, fungiert als Aktivator von MAP4K4, indem es PP2A, einen Inhibitor von MAP4K4, in Abwesenheit von RhoA bindet. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass RhoA der AAA-Bildung durch Hemmung von MAP4K4 in Zusammenarbeit mit Set entgegenwirkt.

Das abdominale Aortenaneurysma (AAA) verursacht einen Aortenriss und einen plötzlichen Tod und ist somit eine lebensbedrohliche Gefäßerkrankung1. AAA wird durch verschiedene Faktoren gebildet, wie z. B. die Veränderung der Krafterzeugung der glatten Gefäßmuskelzellen (VSMC), den Abbau und die Fragmentierung elastischer Fasern, den Verlust medialer VSMCs und Entzündungen2,3. Eine beeinträchtigte Kontraktilität von VSMCs kann ein wichtiger Faktor für die Entstehung von AAA sein. Kürzlich wurde gezeigt, dass VSMCs von AAA-Patienten im Vergleich zu nicht pathologischen Kontroll-VSMCs eine beeinträchtigte maximale Kontraktion aufweisen4. Um auf mechanischen Stress zu reagieren, exprimieren VSMCs hohe Mengen an kontraktilen Proteinen, wie z. B. α-Glattmuskel-Aktin (α-SMA oder ACTA2) und Myosin-Schwerkette 11 der glatten Muskulatur (MYH11). Diese Zellen sind für die Stabilisierung der Aortenwand unerlässlich . Darüber hinaus tragen die kontraktilen Proteine ​​und ihre verwandten Moleküle zur Kraftverteilung in der Aorta bei, indem sie über die Verbindung mit der extrazellulären Matrix (ECM) die mechanischen Eigenschaften regulieren5. Im Gegensatz dazu steigert eine verringerte VSMC-Krafterzeugung die Aktivität der Matrixmetalloproteinasen (MMPs) und die Sekretion entzündlicher Zytokine/Chemokine6,7,8. Um die Bildung von AAA zu verhindern, wird es als wichtig erachtet, VSMCs gesund zu halten. Allerdings ist nicht völlig klar, wie die Kontraktionsfähigkeit des VSMC reguliert wird.

RhoA ist eine GTPase, die in VSMCs reichlich exprimiert wird9,10. Die Aktivität von RhoA wird durch seinen Wechsel zwischen der aktiven GTP-gebundenen Form und der inaktiven GDP-gebundenen Form reguliert11. Um RhoA zu aktivieren, induzieren Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren die Freisetzung von GDP aus RhoA, was zur Einbindung von GTP aus dem Zytosol führt. Aktiviertes RhoA leitet dann Signale an nachgeschaltete Effektoren weiter12. Zur RhoA-Inaktivierung stimulieren GTPase-aktivierende Proteine ​​(GAPs) die intrinsische Hydrolyseaktivität von RhoA, um GTP zu GDP zu hydrolysieren. RhoA hat mehrere Funktionen bei der Regulierung von VSMCs und trägt zur morphologischen Unterstützung und Aufrechterhaltung der Aortenstruktur bei13. Rho-assoziierte Coiled-Coil-enthaltende Kinase (ROCK), ein Molekül stromabwärts von RhoA, vermittelt die meisten Funktionen von RhoA, einschließlich Aktindynamik, Zellkontraktion und Zellmotilität14. Funktionsstörungen von RhoA/ROCK wurden mit der Pathogenese von Arteriosklerose, ischämischen Verletzungen, pulmonaler Hypertonie und Herzinsuffizienz in Verbindung gebracht, was zur Entwicklung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen führte15. Die Rolle von RhoA im Gefäßsystem durch ROCK wurde eingehend untersucht. Allerdings bleibt unklar, wie RhoA selbst in VSMCs die Homöostase der Aorta reguliert.

Basierend auf dem oben beschriebenen Hintergrund untersuchten wir die RhoA-Expressionsniveaus im Normal- und AAA-Bereich von Patienten mit AAA und stellten fest, dass das Niveau in der medialen Schicht des AAA-Bereichs signifikant reduziert war. Um die Funktion von RhoA in Aorta-VSMCs weiter zu untersuchen, wurden VSMC-spezifische RhoA-Conditional-Knockout-Mäuse (cKO) durch das Cre/loxP-System erzeugt. Die pharmakologische Stimulation induzierte bei RhoA-cKO-Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen eine starke AAA-Bildung. Der Verlust von RhoA in VSMCs verringerte die Kontraktilität der Aortenringe und VSMCs sowie die Expression von mit der Kontraktilität verbundenen Genen erheblich und verstärkte die Entzündungsreaktion und Endothelschädigung, was zu proteolytischen und entzündlichen VSMC-Phänotypen führte. Wir haben gezeigt, dass die Hemmung der mitogenaktivierten Proteinkinase-Kinase-Kinase-Kinase 4 (MAP4K4) durch RhoA in VSMCs für die Verhinderung der AAA-Bildung wichtig ist. Unsere Proteomikanalyse trug außerdem dazu bei, den zugrunde liegenden molekularen Mechanismus aufzuklären, durch den RhoA MAP4K4 negativ regulierte.

Bevor wir die RhoA-Expression im menschlichen AAA untersuchten, bestätigten wir die zerstörte mediale Schicht und den Verlust intakter medialer elastischer Fasern in der Aortenwand von AAA-Patienten durch Hämatoxylin- und Eosin- (HE) und Elastin-spezifische Verhoeff Van Gieson-Färbung (Abb. 1a, b). ). Immunhistochemie und Immunfärbung der Aorta ergaben, dass die RhoA-Expression in der medialen Schicht des AAA-Bereichs im Vergleich zum normalen Bereich deutlich verringert war (Abb. 1c – f). In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen zeigten qPCR und Western Blot von Aortenwandproben eine signifikant verringerte Expression von RhoA-mRNA und -Protein im AAA-Bereich (Abb. 1g – i). Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass die RhoA-Expression bei menschlichem AAA verringert ist und legen nahe, dass eine verringerte RhoA-Expression an der Entwicklung von AAA beteiligt sein könnte. Darüber hinaus waren die Expressionsniveaus von VSMC und den Endothelzellmarkerproteinen α-SMA bzw. CD31 im AAA-Bereich aufgrund der Zerstörung sowohl der medialen als auch der Endothelschichten der Aortenwand verringert, während das Niveau des Fibroblasten-Markerproteins Vimentin verringert war war zwischen den normalen und AAA-Bereichen ähnlich (Abb. 1h, i).

a Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (HE) von normalen und abdominalen Aortenaneurysma-Bereichen (AAA) in der menschlichen Aorta. Gepunktete Rechtecke werden vergrößert und unten angezeigt. b Verhoeff Van Gieson-Färbung von Normal- und AAA-Bereichen. c Immunhistochemie von RhoA im normalen und AAA-Bereich der Aorta. Gepunktete Rechtecke werden vergrößert und unten angezeigt. d Zusammenfassendes Diagramm der in (c) untersuchten RhoA-Expression. n = 6 in Normal und n = 9 in AAA. e Immunfärbung von RhoA in normalen Bereichen und AAA-Läsionen. F-Aktin und Kerne wurden mit Phalloidin bzw. DAPI gegengefärbt. f Zusammenfassendes Diagramm der in (e) untersuchten RhoA-Expression. n = 7 in Normal und n = 12 in AAA. g qPCR-Analyse für RHOA-mRNA aus normalen und AAA-Bereichen. Als Kontrolle wurde GAPDH verwendet. n = 11 in Normal und n = 15 in AAA. h Western Blot für RhoA und andere Markerproteine ​​in normalen und AAA-Bereichen. Als Ladekontrolle diente GAPDH. i Zusammenfassende Diagramme der relativen Expression von RhoA und anderen in (h) untersuchten Markerproteinen. n = 6 in Normal und n = 8 in AAA. Maßstabsbalken: 500 μm (a–c) und 30 μm (e). In (d, f, g, i) wurden die Daten zwischen den beiden Gruppen per t-Test analysiert. ***p < 0,001 vs. Normal.

Um festzustellen, ob eine beeinträchtigte RhoA-Expression in der medialen Schicht der Aorta zur Entwicklung von AAA beiträgt, haben wir mithilfe des Cre/loxP-Systems VSMC-spezifische RhoA-cKO-Mäuse erzeugt. RhoA-cKO-Mäuse zeigten normales Wachstum und wurden im Mendelschen Verhältnis geboren; Die Mäuse zeigten im Vergleich zu den Kontrolltieren keine groben phänotypischen Unterschiede, auch nicht in der Fruchtbarkeit. Wir haben das Fehlen einer RhoA-Expression in der medialen Schicht der RhoA-cKO-Mausaorta durch Immunfluoreszenzfärbung bestätigt (ergänzende Abbildung 1a). Eine hämodynamische Studie zeigte eine ähnliche Herzfrequenz und einen ähnlichen systolischen Blutdruck (BP) zwischen Kontroll- und RhoA-cKO-Mäusen, zumindest durch eine Stichprobenkontrolle unter Verwendung der Schwanzmanschettenmethode (ergänzende Abbildung 1b). Das äußere Erscheinungsbild der Aorta war sowohl bei Kontrollmäusen als auch bei RhoA-cKO-Mäusen deutlich und es wurde kein AAA gebildet (ergänzende Abbildung 1c). Bei der Ultraschalluntersuchung konnte keine signifikante Dilatation oder ein Unterschied im Durchmesser der Bauchaorta zwischen Kontroll- und RhoA-cKO-Mäusen festgestellt werden (ergänzende Abbildung 1d, e). Darüber hinaus zeigten HE- und Verhoeff Van Gieson-Färbungen intakte Aorten sowohl bei Kontrollmäusen als auch bei RhoA-cKO-Mäusen (ergänzende Abbildung 1f, g). Tropoelastin, kodiert durch das Eln-Gen, und Fibrillin-1, kodiert durch das Fbn1-Gen, sind die Hauptbestandteile der medialen Schicht der Aorta und spielen eine Rolle bei der Regulierung der Aortenelastizität16. Die Spiegel an Eln- und Fbn1-mRNAs waren in der Aorta bei beiden Mäusetypen ähnlich (ergänzende Abbildung 1h). Wir untersuchten außerdem die Kollagenproduktion und die Kollagenvernetzung in den Aortenproben der Maus, die sich auf die Stärke der Aortenwand auswirken können, mittels qPCR und Hydroxyprolin-Assay. Der mRNA-Spiegel von Kollagen Typ I α1, dem Hauptbestandteil von Kollagen Typ I, war zwischen den Aorten von Kontroll- und RhoA-cKO-Mäusen ähnlich. Der Hydroxyprolin-Assay zeigte auch, dass Gesamtkollagen und vernetztes Kollagen gleichermaßen in den Aorten beider Mäusetypen enthalten waren (ergänzende Abbildung 1i, j). Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Verlust von RhoA in VSMCs unter normalen Bedingungen zumindest in den sechs Monaten nach der Geburt keinen Einfluss auf die Morphologie und Funktion der Aorta hat.

Es wurde berichtet, dass die Aktivität der Cre-Rekombinase, die unter dem SM22α-Promotor gesteuert wird, sowohl im Herzen als auch in VSMCs von Mäusen beobachtet wurde17 und dass die Inaktivierung des Zielgens im Herzen solcher cKO-Mäuse gezeigt wurde18. Basierend auf diesen früheren Veröffentlichungen haben wir die Expression von RhoA im Herzen von Embryonen und erwachsenen Mäusen überprüft. Die RhoA-Expression war sowohl in den sich entwickelnden als auch in den erwachsenen Herzen von RhoA-cKO-Mäusen im Vergleich zu denen von Kontrollmäusen tatsächlich verringert, ging jedoch nicht vollständig verloren (ergänzende Abbildung 2a – d). Trotz der verringerten Expression von RhoA im Herzen blieben die Kontraktilität und die Dimensionen des Herzens bei erwachsenen RhoA-cKO-Mäusen erhalten (ergänzende Abbildung 2e), was darauf hindeutet, dass eine gewisse Verringerung der kardialen RhoA-Expression bei RhoA-cKO-Mäusen keinen Einfluss auf die Herzfunktion hat.

Basierend auf den oben beschriebenen Ergebnissen der RhoA-cKO-Mäuse untersuchten wir als nächstes die biologische Bedeutung von RhoA in VSMCs unter pharmakologischer Stimulation. Angiotensin II (AngII) und β-Aminopropionitril (BAPN) wurden Kontroll- und RhoA-cKO-Mäusen unter Verwendung osmotischer Minipumpen 4 Wochen lang verabreicht, um AAA zu induzieren. Während der AngII- und BAPN-Verabreichung wurden zwischen den Gruppen keine Unterschiede im Körpergewicht, der Herzfrequenz und dem systolischen Blutdruck, gemessen mit der Schwanzmanschettenmethode, beobachtet (Abb. 2a). Allerdings war die Häufigkeit der AAA-Bildung bei RhoA-cKO-Mäusen signifikant höher als bei Kontrollmäusen (Tabelle 1 und Abb. 2b). Wir haben Kontrollmäuse, bei denen AAA gebildet wurde, weiter analysiert und festgestellt, dass die RhoA-Expression im AAA-Bereich im Vergleich zum normalen Bereich deutlich verringert war (ergänzende Abbildung 3a – c), was auf die Bedeutung von RhoA für die Prävention von AAA schließen lässt. Obwohl sich die Länge der Aorta zwischen Kontroll- und RhoA-cKO-Mäusen nicht unterschied (Abb. 2c), war der durch Ultraschall gemessene Durchmesser der Bauchaorta bei RhoA-cKO-Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen signifikant größer (Abb. 2d, e). Die histologische Analyse durch HE- und Verhoeff Van Gieson-Färbung zeigte, dass die Störung und der Abbau der medialen elastischen Lamina in der Aorta bei RhoA-cKO-Mäusen schwerwiegender waren als bei Kontrollmäusen (Abb. 2f – h). Darüber hinaus waren die Eln- und Fbn1-mRNA-Spiegel nach Ang II- und BAPN-Infusion bei RhoA-cKO-Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen signifikant verringert (Abb. 2i). Frühere Studien deuten darauf hin, dass ein abnormaler Anstieg der Proteoglykan-Aggregation in der Aorta zu Störungen der Zell-Matrix-Interaktionen, einer Beeinträchtigung der Mechanosensierung der Aorta und der strukturellen Integrität führen kann und ein Kennzeichen einer medialen Degeneration in der Aorta sein kann19,20,21. Daher führten wir eine Immunfärbung durch, um die Aggrecan-Expression in der Aorta nachzuweisen, und stellten fest, dass die Expression an der Stelle der Aortenruptur bei RhoA-cKO-Mäusen deutlich hochreguliert und akkumuliert war (Abb. 2j). Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass RhoA in VSMCs eine schützende Rolle gegen die Stimulation zur Bildung von AAA spielt.

a Veränderungen des Körpergewichts und der Hämodynamik vor (Woche 0) und nach der Behandlung mit AngII und BAPN. n = 14, jede Gruppe. b Äußeres Erscheinungsbild der Aorta mit entnommenem Herzen und Nieren nach der 4-wöchigen Behandlung. Pfeile zeigen gebildetes AAA an. c Länge der Aorta von der Aortenklappe bis zur Gabelung der A. iliaca communis. d Ultraschalluntersuchung der Bauchaorta, die durch gelbe gepunktete Linien umrandet ist, nach der Behandlung. e Übersichtsgrafik des Bauchaortendurchmessers. n = 6, jede Gruppe. f HE-Färbung der Aorta. g Verhoeff Van Gieson-Färbung der Aorta. h Zusammenfassendes Diagramm des in (g) analysierten Elastinabbaugrades. n = 5, jede Gruppe. i qPCR-Analyse von Genen im Zusammenhang mit der Aortenelastizität. n = 13 in der Kontrolle und n = 10 in RhoA cKO für Eln und n = 10 in der Kontrolle und n = 8 in RhoA cKO für Fbn1. j Co-Immunfärbung von Aggrecan und α-SMA in der Mausaorta nach der Behandlung. Die Kerne wurden mit DAPI gegengefärbt. Pfeilspitzen: Position der AAA-Ruptur (f, g, j). Maßstabsbalken: 1 mm (d) und 100 μm (f, g, j). In (a) wurde eine zweifaktorielle oder einfaktorielle ANOVA angewendet, um die Daten zwischen Gruppen bzw. Wochen zu vergleichen, und in (c, e, h, i) wurden die Daten zwischen den beiden Gruppen mittels t-Test analysiert . †p < 0,05, ††p < 0,01 und †††p < 0,001 im Vergleich zu Woche 0; *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001 im Vergleich zur Kontrolle.

Als nächstes untersuchten wir die Rolle von RhoA in VSMCs bei der Kontraktilität der Aorta und VSMCs. Nach 4-wöchiger Infusion von Kochsalzlösung oder sowohl AngII als auch BAPN wurde die isometrische Spannung der isolierten Mausaorta mit einem Drahtmyographen gemessen. Die Aorten von Kontrollmäusen widerstanden der höchsten Spannung, die durch den Multidraht-Myographen erzeugt wurde, nach der Infusion von Kochsalzlösung und AngII+BAPN auf ähnlichem Niveau, während die Aorten von RhoA-cKO-Mäusen zerbrechlich waren und unabhängig von der Behandlung mit Kochsalzlösung oder der niedrigeren Aortenspannung aufrechterhielten AngII+BAPN (Abb. 3a). Wir führten auch einen In-vitro-Kollagengel-Kontraktilitätstest unter Verwendung isolierter VSMCs aus der Kontroll- und RhoA-cKO-Mausaorta durch. Wir fanden heraus, dass unabhängig von der AngII-Behandlung die Verringerung des Durchmessers des Kollagengels, das RhoA-cKO-VSMCs enthielt, im Vergleich zu dem des Gels, das Kontroll-VSMCs enthielt, erheblich beeinträchtigt war (Abb. 3b, c). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass RhoA-cKO-VSMCs eine geringere Kontraktilität aufweisen als Kontroll-VSMCs.

a Veränderungen der Aortenringspannung, gemessen mit einem Drahtmyographen. n = 6, jede Gruppe. b In-vitro-Kollagengel-Kontraktilitätstest unter Verwendung isolierter Maus-Aorten-VSMCs durch Behandlung mit Kochsalzlösung oder AngII. c Zusammenfassendes Diagramm des in (b) untersuchten VSMC-haltigen Kollagengeldurchmessers. n = 7–10, jede Gruppe. d Immunfärbung von α-SMA in der Mausaorta nach der 4-wöchigen Behandlung. e Immunfluoreszenzbilder von Aorten-VSMCs, die nach 24-stündiger Behandlung mit Kochsalzlösung oder AngII mit dem α-SMA-Antikörper gefärbt wurden. F-Aktin und Kerne wurden mit Phalloidin bzw. DAPI in (d, e) sichtbar gemacht. f Western Blot von α-SMA in Aorten-VSMCs nach 24-stündiger Behandlung mit Kochsalzlösung oder AngII. Zur Ladekontrolle wurde GAPDH geblottet. g Zusammenfassendes Diagramm des in (f) untersuchten α-SMA/GAPDH-Verhältnisses. n = 6, jede Gruppe. h qPCR-Analyse von Genen im Zusammenhang mit dem kontraktilen VSMC-Phänotyp. Aorten-VSMCs wurden 24 Stunden lang mit Kochsalzlösung oder AngII behandelt. n = 8, jede Gruppe. Maßstabsbalken: 2 mm (b), 20 μm (d) und 50 μm (e). Zum Vergleich der Daten zwischen den Gruppen wurde eine zweifaktorielle (a, c) oder einfaktorielle (g, h) ANOVA angewendet. *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001 vs. Kontrolle in der gleichen Behandlung; †††p < 0,001 vs. Kontrolle bei der Kochsalzlösung.

Anschließend überprüften wir die Kontroll- und RhoA-cKO-Aorten und VSMCs, indem wir Marker für die kontraktile VSMC-Struktur, wie z. B. α-SMA6, untersuchten. Immunfluoreszenz- und Western-Blot-Analysen zeigten, dass die α-SMA-Expression in der RhoA-cKO-Aorta und den VSMCs im Vergleich zu den Kontrollzellen verringert war (Abb. 3d – g). Darüber hinaus wurde eine verringerte und desorganisierte Expression von F-Actin als Reaktion auf den Verlust von RhoA in der Aorta und den VSMCs beobachtet (Abb. 3d, e). Die verringerte Expression von α-SMA und die Beeinträchtigung von F-Actin wurden auch im AAA-Bereich der Kontrollaorta festgestellt (ergänzende Abbildung 3b). qPCR ergab eine signifikant verringerte Expression anderer kontraktiler Markergene, Mylk und Myh11 sowie Acta2, in RhoA-cKO-VSMCs im Vergleich zu Kontroll-VSMCs (Abb. 3h). Wir führten außerdem die Rettungsexperimente durch, um zu bestätigen, dass die verringerte Expression von α-SMA und anderen kontraktilen VSMC-Markergenen spezifisch vom Verlust von RhoA in VSMCs abhängt. Wenn GFP-RhoA-Wildtyp (WT) in RhoA-cKO-VSMCs auf dem Niveau wie Kontroll-VSMCs erneut exprimiert wurde, wurde die α-SMA-Proteinexpression vollständig wiederhergestellt und in den Zellen wurde eine normale F-Actin-Organisation beobachtet (ergänzende Abbildung). 4a–c). In ähnlicher Weise wurde die verringerte Expression kontraktiler Markergene in RhoA-cKO-VSMCs durch erneute Expression von GFP-RhoA-WT wiederhergestellt (ergänzende Abbildung 4d).

Da Funktionsstörungen und Desorganisation der medialen Schicht der Aorta normalerweise die Funktion der Endothelbarriere beeinträchtigen und umgekehrt22,23, untersuchten wir die Morphologie der Endothelschicht und stellten fest, dass die Schicht nach AngII+ hauptsächlich an der Stelle von AAA bei RhoA-cKO-Mäusen gestört war BAPN-Behandlung (Abb. 4a). Diese beeinträchtigte endotheliale Barrierefunktion in der RhoA-cKO-Aorta wurde durch die Ansammlung von Farbstoffen in der Aortenwand weiter bestätigt. Wenn den Mäusen der Farbstoff Evans Blue intravenös injiziert wurde, war die Farbstoffanreicherung bei mit AngII + BAPN behandelten RhoA-cKO-Mäusen signifikant erhöht (Abb. 4b, c). Durch die Störung können Entzündungszellen in die Aortenwand eindringen. Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte, dass bei der Kochsalzinfusion die Infiltration entzündlicher Zellen, bestimmt durch CD68- und F4/80-Marker, sowohl in der Kontroll- als auch in der RhoA-cKO-Aorta minimal war, aber als Reaktion auf die Behandlung mit AngII+BAPN war die Infiltration in der RhoA-cKO-Aorta deutlich erhöht (Abb. 4d, e). Entzündliche Zytokine erleichtern die Zerstörung der Endothelschicht und die Infiltration entzündlicher Zellen24. Als nächstes untersuchten wir die Expression von entzündlichen Zytokinen und stellten fest, dass diese in der RhoA-cKO-Aorta nach einer 4-wöchigen Infusion von Reagenzien und in isolierten RhoA-cKO-VSMCs nach AngII-Stimulation erhöht war (Abb. 4f, g). Darüber hinaus wurde der Anstieg der Expression entzündlicher Zytokine in RhoA-cKO-VSMCs durch Transfektion von GFP-RhoA-WT in den Zellen umgekehrt (ergänzende Abbildung 4e). Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Verlust von RhoA in Aorten-VSMCs die Gefäßentzündung durch die Hochregulierung der Zytokinproduktion verstärkt.

a Immunfluoreszenzbilder der Kontroll- und RhoA-cKO-Mausaorta, gefärbt mit dem Anti-CD31-Antikörper. Die Aorta wurde nach der 4-wöchigen Behandlung mit Kochsalzlösung oder AngII+BAPN extrahiert. F-Aktin und Kerne wurden mit Phalloidin bzw. DAPI sichtbar gemacht. Ein Pfeil und eine Pfeilspitze zeigen den Verlust von Endothel bzw. die Infiltration von Entzündungszellen an. b Gefäßpermeabilitätstest zur Bewertung der endothelialen Barrierefunktion in der Aorta. 10 Minuten nach der intravenösen Injektion von Evans Blue-Farbstoff wurde die Aorta von Mäusen, die mit Kochsalzlösung oder AngII+BAPN behandelt wurden, extrahiert und die Farbstoffakkumulation gemessen. c Zusammenfassendes Diagramm der mittleren Intensität der Evans Blue-Farbstoffakkumulation. n = 5, jede Gruppe. d Immunfluoreszenzbilder der Kontroll- und RhoA-cKO-Mausaorta, gefärbt mit dem CD68- oder F4/80-Antikörper. Die Aorta wurde wie in (a) beschrieben extrahiert. e Zusammenfassende Grafik des Prozentsatzes der CD68-positiven Fläche oder F4/80-positiven Fläche in der Media der Aorta. n = 3–7, jede Gruppe. f, g Diagramme der qPCR-Ergebnisse für entzündliche Zytokine in der Mausaorta (f) und Aorten-VSMCs (g). Die Aorta wurde wie in (a) beschrieben extrahiert und VSMCs wurden 24 Stunden lang mit Kochsalzlösung oder AngII behandelt. n = 3–6, jede Gruppe. Maßstabsbalken: 30 μm (a, d) und 1 mm (b). In (c, e, f, g) wurde eine einfache ANOVA angewendet, um die Daten zwischen den Gruppen zu vergleichen. *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001 im Vergleich zur Kontrolle in derselben Behandlung. †p < 0,05, ††p < 0,01 und †††p < 0,001 vs. RhoA cKO in der Kochsalzlösung.

Um die möglichen Mechanismen für die erhöhte Elastinzerstörung in der RhoA-cKO-Aorta weiter zu untersuchen, untersuchten wir die Expression von MMP2 und MMP9, die Schlüsselproteinasen bei der Proteinzerstörung der extrazellulären Matrix (ECM) sind. Der Mmp2-mRNA-Spiegel in AngII-stimulierten kultivierten VSMCs war im RhoA-cKO signifikant höher als in der Kontrolle (ergänzende Abbildung 5a). Die Immunfärbung zeigte, dass die MMP2-Expression in der Aorta bei RhoA-cKO-Mäusen im Vergleich zu den Kontrollmäusen nach Behandlung mit AngII und BAPN erhöht war (ergänzende Abbildung 5b, c). Ähnliche Ergebnisse wurden für die MMP9-Expression erhalten (ergänzende Abbildungen 5a, d, e). Im Gegensatz dazu waren die Expressionen der Gewebeinhibitoren von Metalloproteinase 1 (TIMP1) und TIMP2, die endogene Inhibitoren für MMPs sind, in kultivierten VSMCs und der Aorta von RhoA-cKO-Mäusen deutlich verringert (ergänzende Abbildung 5f – j), was darauf hindeutet, dass beide MMPs erhöhten Die Expression und ihre erhöhte Aktivität aufgrund der verringerten Expression von TIMPs tragen gemeinsam zum starken Abbau von ECM für die AAA-Bildung in der Aorta von RhoA-cKO-Mäusen bei. Bei der Zymographie unter Verwendung menschlicher Aortengewebeproben wurden in der AAA-Läsion auch höhere Mengen an pro- und reifem MMP2 und MMP9 festgestellt als im normalen Bereich (ergänzende Abbildung 5k, l). Diese Daten deuten darauf hin, dass RhoA die Expression und Aktivierung von MMPs hemmt, was nach pharmakologischer Stimulation zu weniger ECM-Anomalien in der Aorta von Kontrollmäusen führt.

Als nächstes wollten wir den Signalweg untersuchen, der für die Entzündung und MMP-Expression in VSMCs der Aorta verantwortlich ist. Frühere Studien haben gezeigt, dass mitogenaktivierte Proteinkinase-Signalfaktoren (MAP), wie z. B. extrazelluläre signalregulierte Kinase (ERK) und p38, die oben genannten Phänomene regulieren25,26. Daher untersuchten wir die Aktivität (Phosphorylierungsgrad) von ERK1/2 und p38. Das Immunfluoreszenzsignal von phosphoryliertem ERK1/2 und p38 war in der RhoA-cKO-Aorta im Vergleich zur Kontrollaorta nach der 4-wöchigen AngII+BAPN-Behandlung erhöht (Abb. 5a – d). Dieser Anstieg wurde auch bei mit AngII stimulierten VSMCs beobachtet (Abb. 5e, f). Um das Molekül, das die Aktivität von MAP-Kinasen reguliert, weiter zu erforschen, konzentrierten wir uns auf MAP4K427,28, das auch mit Gefäßentzündungen und der Kontraktilität von Kardiomyozyten zusammenhängt29,30. Die durch pharmakologische Stimulation induzierte Aktivierung (Phosphorylierung) von MAP4K4 war in der Aorta und in isolierten VSMCs von RhoA-cKO-Mäusen signifikant höher als in denen von Kontrollmäusen (Abb. 5g – j). Darüber hinaus wurde die durch AngII induzierte Verstärkung des MAP-Kinase-Signalwegs in RhoA-cKO-VSMCs durch erneute Expression von GFP-RhoA-WT auf das Niveau in Kontroll-VSMCs zurückgeführt (ergänzende Abbildung 4f, g). Die Spezifität von Antikörpern für die Immunfärbung mit phosphoryliertem ERK1/2, p38 und MAP4K4 wurde durch Experimente unter Verwendung der RhoA-cKO-Aorten nach Inhibitorverabreichung validiert. Die Signale für phosphoryliertes ERK1/2, p38 und MAP4K4, die durch AngII+BAPN-Behandlung eindeutig nachgewiesen wurden, verschwanden in Gegenwart des Inhibitors jedes MAP-Kinase-Signalmoleküls (ergänzende Abbildung 6). In der menschlichen Aorta war die Aktivierung von MAP4K4 in der AAA-Läsion im Vergleich zum normalen Bereich verstärkt (Abb. 5k – n), und selbst bei Kontrollmäusen wurde die verstärkte Aktivierung auch an der Stelle von AAA beobachtet (ergänzende Abb. 3d). , e). Diese Ergebnisse legen nahe, dass RhoA in VSMCs die MAP-Kinase-Signalkaskade abschwächen kann, um die AAA-Bildung zu verhindern.

a, c, g, k Immunfluoreszenzbilder der Kontroll- und RhoA-cKO-Mausaorta nach der 4-wöchigen Behandlung mit AngII+BAPN (a, c, g) und von normalen und AAA-Bereichen in der menschlichen Aorta (k). F-Aktin und Kerne wurden mit Phalloidin bzw. DAPI sichtbar gemacht. b, d, h, l Zusammenfassendes Diagramm des Prozentsatzes der positiven Fläche für jedes MAP-Kinase-Signalmolekül. n = 9 in der Kontrolle und n = 10 in RhoA cKO (b), n = 8 in der Kontrolle und n = 10 in RhoA cKO (d) und n = 5, jede Gruppe (h, l). e, i Western Blot mit den angegebenen Antikörpern unter Verwendung kultivierter Aorten-VSMCs nach 24-stündiger Behandlung mit Kochsalzlösung oder AngII. Als Ladekontrolle diente GAPDH. f, j Zusammenfassendes Diagramm des Verhältnisses von phosphorylierten/gesamten MAP-Kinase-Signalmolekülen in jeder Gruppe. n = 3–5, jede Gruppe. m Western Blot für P-MAP4K4 und Gesamt-MAP4K4 in normalen und AAA-Bereichen in der menschlichen Aorta. n Zusammenfassendes Diagramm des P-MAP4K4/MAP4K4-Verhältnisses. n = 4, jede Gruppe. Maßstabsbalken: 20 μm (a, c, g, k). In (b, d, h, l, n) wurden die Daten zwischen den beiden Gruppen mittels t-Test analysiert, und in (f, j) wurde eine einfache ANOVA angewendet, um die Daten zwischen den Gruppen zu vergleichen. *p < 0,05 und ***p < 0,001 vs. Kontrolle oder Normal; †p < 0,05 und †††p < 0,001 vs. RhoA cKO in der Kochsalzlösung.

Wir haben die Bedeutung der MAP4K4-Aktivität für die AAA-Bildung in Abwesenheit von VSMC RhoA mithilfe des MAP4K4-Inhibitors DMX-5804 weiter untersucht. Die AAA-Bildung wurde durch intravenöse Behandlung mit DMX-5804 zusätzlich zu AngII und BAPN bei RhoA-cKO-Mäusen signifikant reduziert, ohne dass sich die Hämodynamik änderte (Tabelle 2, Abb. 6a und ergänzende Abb. 7a). Histologische Analysen zeigten, dass die Behandlung mit DMX-5804 die ungünstige Morphologie und den Abbau der RhoA-cKO-Aorta umkehrte, ähnlich wie bei der mit DMX-5804 behandelten Kontrollaorta (Abb. 6b – d). Es wurde auch bestätigt, dass die DMX-5804-Behandlung die Herzfunktionen und das Plasmavolumen sowohl bei RhoA-cKO-Mäusen als auch bei Kontrollmäusen nicht beeinflusste (ergänzende Abbildung 7b, c). Wir fanden außerdem heraus, dass die Aortenspannung von RhoA-cKO-Mäusen durch MAP4K4-Hemmung mit DMX-5804 wiederhergestellt wurde (Abb. 6e). Ein Kollagen-Gel-Kontraktilitätstest unter Verwendung isolierter VSMCs zeigte ebenfalls ähnliche Ergebnisse (Abb. 6f), und morphologische Anomalien mit verringerter α-SMA-Expression und gestörter F-Actin-Organisation in mit AngII behandelten VSMCs wurden durch DMX-5804 umgekehrt (Abb. 6g).

a Äußeres Erscheinungsbild der Aorta mit Herz- und Nierenextraktion nach der 4-wöchigen Behandlung mit AngII und BAPN in Gegenwart von 0,5 % DMSO (Vehikel) oder DMX-5804 (DMX). Ein Pfeil zeigt gebildetes AAA an. b HE-Färbung der Aorta. c Verhoeff Van Gieson-Färbung der Aorta. d Zusammenfassendes Diagramm des in (c) analysierten Elastinabbaugrades. n = 7–11, jede Gruppe. e Änderungen der Aortenringspannung, gemessen mit einem Drahtmyographen. n = 10 in AngII+BAPN + Fahrzeug und n = 6 in AngII+BAPN + DMX. f Veränderungen des Aorten-VSMCs enthaltenden Kollagengeldurchmessers im In-vitro-Kollagengel-Kontraktilitätstest. n = 10 in AngII+Vehicle und n = 8 in AngII+DMX. g Immunfluoreszenzbilder von Aorten-VSMCs, die nach 24-stündiger Behandlung mit AngII in Gegenwart von Vehikel oder DMX-5804 mit dem α-SMA-Antikörper gefärbt wurden. F-Aktin und Kerne wurden mit Phalloidin bzw. DAPI sichtbar gemacht. h, j Western Blot mit den angegebenen Antikörpern unter Verwendung von Aorten-VSMCs nach 24-stündiger Behandlung mit oder ohne AngII oder DMX-5804. Als Ladekontrolle diente GAPDH. i, k Zusammenfassende Diagramme der Verhältnisse P-MLC2/MLC2, P-MYLK/MYLK und MYLK/GAPDH. n = 4 (i), n = 3–4 (k), jede Gruppe. l Immunpräzipitationsexperimente mit den angegebenen Antikörpern. IgG wurde als Negativkontrolle für die Immunpräzipitation verwendet. m qPCR-Analyse mit VSMCs, die 24 Stunden lang mit oder ohne AngII und/oder DMX-5804 behandelt wurden. n = 4–5, jede Gruppe. Maßstabsbalken: 500 μm (b, c) und 20 μm (g). Zum Vergleich der Daten zwischen den Gruppen wurde eine einfaktorielle (d, i, k, m) oder zweifaktorielle (e, f) ANOVA angewendet. *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001 im Vergleich zu Vehikel oder Kontrolle; ††p < 0,01 und †††p < 0,001 vs. AngII-Behandlung ohne DMX-5804; §p < 0,05 vs. Keine Behandlung.

Da die Kontraktilität von VSMC entscheidend vom Phosphorylierungsgrad der Myosin-Leichtkette 2 (MLC2) abhängt, haben wir den Grad in VSMCs durch Western Blot untersucht. Nach der AngII-Stimulation war phosphoryliertes MLC2 in den Kontroll-VSMCs erhöht, in RhoA-cKO-VSMCs wurde jedoch kein Anstieg festgestellt; Durch die Behandlung von RhoA-cKO-VSMCs mit DMX-5804 wurde der Phosphorylierungsgrad von MLC2 ähnlich wie bei Kontroll-VSMCs wiederhergestellt (Abb. 6h, i). Die Phosphorylierung von MLC2 wird durch das Funktionsgleichgewicht zweier Enzyme reguliert: Myosin-Leichtkettenkinase (MYLK), die die Phosphorylierung von MLC2 induziert, und Myosin-Leichtkettenphosphatase (MLCP), die MLC2 dephosphoryliert und durch ROCK stark gehemmt wird31,32 . In RhoA-cKO-VSMCs war die MYLK-Expression verringert, was mit den mRNA-Ergebnissen in Abb. 3h übereinstimmte, und phosphoryliertes MYLK (die inaktivierte Form von MYLK) war trotz der verringerten Expression von MYLK erhöht (Abb. 6j, k). Die verstärkte Phosphorylierung von MYLK durch Verlust von RhoA wurde durch die Behandlung mit DMX-5804 blockiert. Darüber hinaus zeigten Immunpräzipitationstests, dass MAP4K4 mit MYLK interagierte (Abb. 6l). Diese Ergebnisse legen nahe, dass MAP4K4 MYLK phosphoryliert und inaktiviert, was zu einer Hemmung der MLC2-Phosphorylierung führt. Darüber hinaus beobachteten wir, dass die verringerte Expression von Myh11 und Acta2 in RhoA-cKO-VSMCs durch DMX-5804-Behandlung wiederhergestellt wurde (Abb. 6m). Zusammengenommen weisen diese Daten auf die Beteiligung von MAP4K4 an der Regulierung der VSMC-Kontraktilität hin.

Die hemmende Wirkung von DMX-5804 auf Entzündungen und die MAP-Kinase-Signalisierung wurde in Aortenproben und VSMCs von Mäusen untersucht. Eine zusätzliche Behandlung mit DMX-5804 verringerte die Expressionsniveaus von F4/80 und MMP2 sowie die Phosphorylierung von MAP4K4 in der RhoA-cKO-Mausaorta signifikant (ergänzende Abb. 8a, b). Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass die Hemmung von MAP4K4 mit DMX-5804 in VSMCs die AngII-induzierte Aktivierung von p38- und ERK1/2-Signalen verringerte, die mit Gefäßentzündungen und ECM-Abbau verbunden sind (ergänzende Abb. 8c, d). Tatsächlich wurde die erhöhte Expression entzündlicher Zytokine in RhoA-cKO-VSMCs nach AngII-Behandlung durch DMX-5804 signifikant unterdrückt (ergänzende Abbildung 8e), und die AngII-vermittelten Veränderungen der MMPs- und TIMPs-Expression in RhoA-cKO-VSMCs wurden durch DMX-5804 vollständig aufgehoben (Ergänzende Abb. 8f). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Hemmung von MAP4K4 in VSMCs ohne RhoA die AAA-Bildung unterdrückt, die Kontraktilität von VSMCs wiederherstellt und Gefäßentzündungen und ECM-Abbau durch Inaktivierung des MAP-Kinase-Signals abschwächt.

Um den molekularen Mechanismus zu untersuchen, durch den RhoA die MAP4K4-Aktivität in VSMCs moduliert, führten wir Immunpräzipitation und Massenspektrometrie (MS) durch. Mit GFP-RhoA-Wildtyp (WT) oder GFP-Kontrollvektor transfizierte RhoA-cKO-VSMCs wurden mit AngII stimuliert, und dann wurden die Zelllysate mit Anti-GFP-Antikörper immunpräzipitiert, gefolgt vom Nachweis von Immunpräzipitationsmitteln in Coomassie Brilliant Blue (CBB). ) Färbung (Abb. 7a). Proteine, die zusammen mit GFP-RhoA-WT, jedoch nicht mit GFP, immunpräzipitierten, wurden mittels Flüssigkeitschromatographie (LC)-MS/MS analysiert. Die Analyse identifizierte 1453 Peptide, die zu 359 Proteinen gehörten (Supplementary Data 1). Kürzlich wurde berichtet, dass die MAP4K4-Aktivität durch den Striatin-interagierenden Phosphatase- und Kinase-Komplex (STRIPAK) reguliert wird, der RhoA33,34 nachgeschaltet ist. Basierend auf diesem Bericht führten wir eine In-silico-Analyse für die 359 Proteine ​​durch, um das Protein zu identifizieren, das bevorzugt mit einer Komponente des STRIPAK-Komplexes interagieren kann. Wir fanden heraus, dass Set (Zugangsnummer Q9EQU5) die höchste Punktzahl für die Bindung an Proteinphosphatase 2A (PP2A) hatte, eine STRIPAK-Komponente, die die MAP4K4-Aktivität negativ reguliert, indem sie die MAP4K4-Phosphorylierung reduziert. Frühere Studien zeigten auch, dass Set mit PP2A assoziiert und dessen Phosphataseaktivität hemmt35,36 und dass es die Signalübertragung von Rac1, einer weiteren GTPase der Rho-Familie,37 reguliert.

a Nach der Transfektion des GFP- oder GFP-RhoA-WT-Expressionsplasmids wurden VSMCs 24 Stunden lang mit AngII stimuliert. Die Zellextrakte wurden immunpräzipitiert und mit dem Anti-GFP-Antikörper immungeblottet (oberes Feld), und die immunpräzipitierten Proteine ​​gegen den Anti-GFP-Antikörper wurden durch Coomassie Brilliant Blue (CBB)-Färbung (unteres Feld) nachgewiesen. Einzelstern und Doppelsterne: schwere bzw. leichte IgG-Ketten. Pfeile: transfiziertes GFP oder GFP-RhoA-WT. Von rot gepunkteten Rechtecken umgebene Banden wurden mittels LC-MS/MS weiter analysiert. b Western Blot für P-MAP4K4 und MAP4K4 in Aorten-RhoA-cKO-VSMCs, transfiziert mit Scramble- oder siSet-siRNA. c Zusammenfassendes Diagramm des P-MAP4K4/MAP4K4-Verhältnisses. d Zellextrakte aus Kontroll-VSMCs nach Kochsalzlösung oder AngII-Behandlung wurden in Pulldown-Assays mit GST-Fusionsprotein einschließlich der GTP-gebundenen RhoA-Bindungsdomäne von mDia verwendet, gefolgt von Western Blot mit Anti-Set- oder Anti-RhoA-Antikörper. e Nach 24-stündiger Stimulation der Kontroll- oder RhoA-cKO-VSMCs mit AngII wurden die Zellextrakte mit Anti-PP2A-Antikörper oder Kontroll-IgG immunpräzipitiert, gefolgt von einem Western-Blot mit den angegebenen Antikörpern. f Immunfluoreszenzbilder von Kontroll- oder RhoA-cKO-VSMCs, gefärbt mit den angegebenen Antikörpern nach 24-stündiger Behandlung mit AngII. Kerne wurden mit DAPI visualisiert. Maßstabsbalken: 20 μm. g, j Nach der Transfektion von Zellen mit Scramble- oder siSet-siRNA und AngII-Stimulation für 24 Stunden wurden Zellextrakte von Kontroll- oder RhoA-cKO-VSMCs mit den angegebenen Antikörpern immungeblottet. h, k Zusammenfassende Diagramme der Verhältnisse phosphorylierter/gesamter MAP-Kinase-Signalmoleküle (h) und P-MLC2/MLC2-, P-MYLK/MYLK- und MYLK/GAPDH-Verhältnisse (k). n = 3 (h) und n = 4–5 (k), jede Gruppe. i Zusammenfassendes Diagramm des VSMC-haltigen In-vitro-Kollagengel-Kontraktilitätstests unter Verwendung von AngII-stimulierten RhoA-cKO-VSMCs, transfiziert mit Scramble- oder siSet-siRNA. n = 8, jede Gruppe. Die Daten wurden mittels t-Test (c), einfaktorieller ANOVA (h, k) oder zweifaktorieller ANOVA (i) analysiert, um die Gruppen zu vergleichen. In (c), ***p < 0,001 vs. Scramble; in (h, k), **p < 0,01 und ***p < 0,001 vs. Kontrolle, ††p < 0,01 und †††p < 0,001 vs. Scramble; in (i), *p < 0,05 vs. Scramble.

Um anschließend festzustellen, ob Set tatsächlich zur Regulierung der MAP4K4-Aktivität beiträgt, führten wir Knockdown-Experimente in RhoA-cKO-VSMCs mit AngII-Stimulation durch und stellten fest, dass die Set-siRNA-Transfektion die Phosphorylierung von MAP4K4 signifikant reduzierte (Abb. 7b, c). Dann stellten wir die Hypothese auf, dass als Reaktion auf die AngII-Stimulation in VSMCs die Wechselwirkung von Set mit AngII-induziertem aktiviertem RhoA zunehmen würde, was Set von PP2A dissoziiert, und dass freies PP2A an MAP4K4 binden und die Aktivierung von MAP4K4 hemmen könnte. In Übereinstimmung mit dieser Hypothese war die Wechselwirkung von Set mit GTP-gebundenem RhoA in VSMCs nach AngII-Stimulation erhöht (Abb. 7d). In mit AngII stimulierten Kontroll-VSMCs wurde die Assoziation von PP2A mit MAP4K4 beobachtet, und diese Assoziation wurde durch den Verlust von RhoA aufgrund der PP2A-Set-Bindung beeinträchtigt (Abb. 7e, linke Felder und Abb. 7f), was zur Autophosphorylierung von MAP4K4 führt . Darüber hinaus wurde die Assoziation zwischen PP2A und MAP4K4 wiederhergestellt, als Set in RhoA-cKO-VSMCs ausgeschaltet wurde (Abb. 7e, rechte Tafel). Im Gegensatz dazu wurde die PP2A-Set-Bindung erhöht und die PP2A-MAP4K4-Assoziation sogar in Gegenwart verringert, wenn Kontroll-VSMCs mit HA-markierten Set-Isoform 1 und Isoform 2 (HA-Set1 und HA-Set2) transfiziert und mit AngII stimuliert wurden von RhoA (ergänzende Abbildung 9a), was auf eine ausgewogene und funktionelle molekulare Wechselwirkung zwischen Set, PP2A und MAP4K4 stromabwärts von RhoA schließen lässt.

Schließlich haben wir bestätigt, dass die Set-vermittelte Regulation der MAP4K4-Aktivierung an der Aktivierung von MAP-Kinasen und der VSMC-Kontraktilität stromabwärts von MAP4K4 beteiligt ist. Unter der AngII-Stimulation wurde die Phosphorylierung von ERK1/2 und p38 sowie MAP4K4 in RhoA-cKO-VSMCs durch zusätzlichen Abbau von Set nicht erhöht (Abb. 7g, h). Konsequenterweise blieb die Kontraktilität von VSMCs erhalten, die Phosphorylierung von MLC2 wurde wiederhergestellt und die Phosphorylierung von MYLK wurde in RhoA-cKO-VSMCs mit siSet-Transfektion nicht erhöht (Abb. 7i – k). In AngII-stimulierten Kontroll-VSMCs, die mit HA-Set1 und HA-Set2 transfiziert waren, waren phosphoryliertes MAP4K4, ERK1/2 und p38 im Vergleich zu VSMCs, die mit einem leeren Plasmid transfiziert waren, signifikant erhöht (ergänzende Abb. 9b, c). Darüber hinaus unterdrückte die Überexpression von HA-Set1 und HA-Set2 die Phosphorylierung von MLC2 und erleichterte die Inaktivierung (Phosphorylierung) von MYLK (ergänzende Abbildung 9d, e), was möglicherweise auf die erhöhte Aktivierung von MAP4K4 durch das reichlich vorhandene Set zurückzuführen ist. vermittelte Dissoziation von MAP4K4 von PP2A. Insgesamt legen diese Ergebnisse nahe, dass RhoA die MAP4K4-Aktivierung durch Set und PP2A negativ reguliert, was zur Aufrechterhaltung der Kontraktilität und Morphologie von VSMCs und der Aorta führt.

In dieser Studie haben wir die schützenden Wirkungen von RhoA in VSMCs auf die Bildung von AAA anhand von menschlichem Aortengewebe, einem RhoA-cKO-Mausmodell und In-vitro-Ansätzen identifiziert. Der Verlust von RhoA ist sowohl an der Dysfunktion der VSMC-Kontraktilität als auch an der Verstärkung der Gefäßentzündung beteiligt. Diese Schlussfolgerungen basieren auf den folgenden Erkenntnissen: (1) Die RhoA-Expression war in menschlichen AAA-Läsionen deutlich reduziert, (2) die AAA-Bildung war in mit AngII und BAPN behandelten RhoA-cKO-Mäusen erhöht, (3) die mit der VSMC-Kontraktilität verbundene Genexpression war reduziert durch den Verlust von RhoA und die verminderte VSMC-Kontraktilität mit entzündlicher Zytokinexpression wurde induziert, (4) die Infiltration entzündlicher Zellen und die endotheliale Dysfunktion wurden in der RhoA-cKO-Mausaorta verstärkt, (5) RhoA-Depletion induzierte den ECM-Abbau, wie durch erhöhte MMPs-Aktivität bestimmt und verringert TIMPs-Aktivität und (6) die MAP4K4-vermittelte MAP-Kinase-Kaskade wurde in RhoA-Null-Aorta und VSMCs aktiviert.

Obwohl mehrere Berichte die Beteiligung der Regulatoren von RhoA, wie GAP oder GDP-Dissoziationsstimulator für RhoA, bei thorakalen Aortenaneurysmen zeigten, deren Merkmale sich von AAA unterscheiden39,40, wurde RhoA selbst nicht als prädisponierendes Molekül zur Verhinderung von AAA zertifiziert. was in dieser Studie enthüllt wird. Wir fanden auch heraus, dass RhoA in VSMCs für die Expression von Genen zur Krafterzeugung wie Acta2 und Myh11 und für die Unterdrückung der Gentranskription von Zytokinen/Chemokinen wie Il1b und Ccl2 wichtig ist. Somit förderte die Abreicherung von RhoA in VSMCs zusätzlich zur verringerten Kontraktilität von VSMCs die Expression solcher Zytokine/Chemokine und rekrutierte Entzündungszellen in der Media der Aorta. Angesammelte Entzündungszellen in der Aortenwand produzieren ebenfalls reichlich MMPs und verstärken deren Aktivierung, was zu einer Anfälligkeit der Wand führt41. Diese Phänomene können entscheidend zur Entstehung von AAA beitragen.

MAP4K4 in Endothelzellen fördert Gefäßentzündungen30. MAP4K4 fungiert als vorgeschalteter Regulator des MAP-Kinase-Signalwegs, und die Erschöpfung von MAP4K4 unterdrückt den Signalweg und Entzündungen27,42. In dieser Studie haben wir den Zusammenhang zwischen RhoA und MAP4K4 in VSMCs identifiziert und festgestellt, dass dieser Zusammenhang für die Prävention von AAA wichtig ist. In Gegenwart von RhoA wurden die Aktivitäten von MAP4K4 und MAP-Kinasen auch nach AngII-Stimulation gehemmt, was zu einer Verringerung der Entzündung führte. Im Gegensatz dazu war in Abwesenheit von RhoA in VSMCs die MAP4K4-Aktivität hochreguliert und die Häufigkeit der AAA-Bildung war signifikant erhöht. Als die MAP4K4-Aktivität durch DMX-5804 in RhoA-cKO-Mäusen und RhoA-depletierten VSMCs abgeschwächt wurde, wurde nicht nur die MAP4K4-vermittelte Entzündungsreaktion, sondern auch die Gefäßkontraktilität deutlich wiederhergestellt, indem MYLK- und MLC2-Aktivität sowie Acta2- und Myh11-Expression induziert wurden. Darüber hinaus wurde die durch den Verlust von RhoA induzierte AAA-Bildung durch die Behandlung mit DMX-5804 vollständig gehemmt. Dies zeigt, dass RhoA das Signal an MAP4K4 weiterleitet, um dessen Aktivität zu hemmen, und dass die Hemmung eine schützende Wirkung auf die AAA-Bildung hat, was darauf hindeutet, dass MAP4K4 ein therapeutisches Ziel gegen AAA darstellen könnte.

Ein weiteres Ergebnis unserer Studie ist die Identifizierung eines Signalmoleküls, das RhoA und STRIPAK verbindet, einen Molekülkomplex, der die MAP4K4-Aktivität moduliert. Eine frühere Studie zeigte, dass aktives GTP-gebundenes RhoA die Aktivierung (Phosphorylierung) von MAP4K4 durch PP2A, eine Phosphatase im STRIPAK-Komplex, unterdrückte34. Es ist jedoch unbekannt, wie RhoA die PP2A-Funktion reguliert. Wir führten einen Pulldown-Assay und LC-MS/MS mit AngII-stimulierten VSMCs durch, um die Moleküle zu identifizieren, die sowohl mit RhoA als auch mit PP2A assoziiert sind. Durch die In-silico-Analyse nach der LC-MS/MS wurde festgestellt, dass Set ein Kandidat für die Assoziation ist. Wir haben die molekulare Assoziation außerdem durch Immunpräzipitation bestätigt und festgestellt, dass aktiviertes RhoA bevorzugt an Set bindet, wodurch Set von PP2A dissoziiert wird. Da Set ein Suppressor von PP2A35,36 ist, induziert die Dissoziation von Set von PP2A die PP2A-Aktivierung und die anschließende MAP4K4-Hemmung. Umgekehrt hob der Abbau von Set in RhoA-cKO-VSMCs den Anstieg der Phosphorylierung von MAP4K4 und seinen nachgeschalteten MAP-Kinasen auf und stellte die Kontraktilität von VSMCs in Gegenwart einer AngII-Behandlung wieder her. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Set ein weiteres therapeutisches Ziel gegen AAA darstellen könnte. Abschließend sind unsere Ergebnisse dieser Studie in der ergänzenden Abbildung 10 schematisch zusammengefasst.

Obwohl die Forschung zu AAA weiter zunimmt, sind die Behandlungsmöglichkeiten für diese verheerende Gefäßerkrankung immer noch begrenzt43,44. AAA ist eine lebensbedrohliche fortschreitende Gefäßerkrankung, die sich schleichend entwickelt und häufig zum plötzlichen Tod durch Aortenruptur führt. Daher sind eine frühzeitige Diagnose und die Entdeckung neuartiger Behandlungen notwendig, um die Entwicklung der AAA-Bildung zu verhindern. Frühere Studien haben gezeigt, dass genetische Störungen in VSMCs eine entscheidende Rolle bei AAA2 spielen. In dieser Hinsicht ergänzt die vorliegende Studie das aktuelle Verständnis der AAA-Pathologie und zeigt, dass RhoA Krafterzeugungsproteine ​​reguliert, um die Kontraktilität der Aorta aufrechtzuerhalten, und Gefäßentzündungen hemmt, die durch MAP4K4 vermittelt werden. Obwohl weitere Studien erforderlich sind, spekulieren wir, dass RhoA ein diagnostischer Biomarker für AAA sein könnte und dass die Aufrechterhaltung seiner Expression in VSMCs der Aorta wichtig ist, um der AAA-Bildung und der Prognose dieser Krankheit entgegenzuwirken.

Eine der Einschränkungen dieser Studie könnte darin bestehen, dass die AAA-Bildung durch die pharmakologische Stimulation von AngII und BAPN in RhoA-cKO-Mäusen induziert wurde, während menschliches AAA im Allgemeinen durch alters- und/oder atherosklerosebedingte Hypertonie und Aortenwand gebildet wird Verletzlichkeit45,46. Im Grundzustand konnten wir keine Unterschiede zwischen Kontroll- und RhoA-cKO-Mäusen feststellen. Es besteht möglicherweise die Möglichkeit, dass eine erhöhte Expression anderer Mitglieder der Rho-Familie, wie z. B. RhoB, den Verlust von RhoA in der medialen Schicht der Aorta ausgleicht, um die Aortenstruktur normal zu halten. Angesichts der Tatsache, dass die Verabreichung von AngII und BAPN häufig zur Erzeugung des tierischen AAA-Modells47,48 verwendet wird, könnte die Verwendung dieser Reagenzien für die Untersuchung der Funktion des Zielmoleküls, wie z. B. RhoA, im Prozess und Mechanismus der AAA-Bildung akzeptabel sein. Es könnte interessant sein, weiter zu untersuchen, ob die AAA-Bildung durch Alterung bei RhoA-cKO-Mäusen beschleunigt wird. Da dies zu lange dauert und den Rahmen dieser Studie sprengt, wäre es ein zukünftiger experimenteller Forschungsplan.

Zusammenfassend konnten wir erfolgreich zeigen, dass VSMC RhoA der AAA-Bildung im cKO-Mausmodell entgegenwirkte, und den Mechanismus aufdecken, dass RhoA die MAP4K4-Aktivität durch Set unterdrückt, um AAA zu verhindern. Was die translationalen und klinischen Implikationen betrifft, so kehrte ein MAP4K4-Inhibitor DMX-5804 die nachteiligen Phänomene der AAA-Bildung, die durch den Verlust von RhoA in VSMCs hervorgerufen wurden, um und bot diesem Inhibitor ein therapeutisches Potenzial für AAA, bei dem die RhoA-Expression und die MAP4K4-Aktivität deutlich verringert waren. Dies ist eine wertvolle Erkenntnis, da es derzeit keine wirksame pharmazeutische Behandlung für AAA gibt.

Alle Protokolle mit menschlichen Aortenproben wurden von der Forschungsethikkommission der Shiga University of Medical Science genehmigt und entsprechen den in der Deklaration von Helsinki dargelegten Grundsätzen. Aortengewebe wurde von Patienten mit AAA nach der Operation gewonnen. Die klinischen Merkmale der Patienten sind in der Ergänzungstabelle 1 zusammengefasst. Alle Patienten gaben eine schriftliche Einverständniserklärung zur Verwendung von Aortengewebe für diese Studie ab.

Wir haben RhoA-floxierte Mäuse durch homologe Rekombination des RhoA-Allels in embryonalen Stammzellen (ES) erzeugt. Der Zielvektor enthielt Exon 3 des RhoA-Gens, flankiert von loxP-Stellen und dem neo-Gen. ES-Zellen wurden mit dem Vektor transfiziert und durch Behandlung mit G418 selektiert. Das neo-Gen wurde durch vorübergehende Verabreichung von Cre-Rekombinase entfernt. ES-Zellen, die das RhoA-floxed-Allel ohne Neo enthielten, wurden in Blastozysten mikroinjiziert, um chimäre Mäuse zu erzeugen. Die chimären Mäuse wurden weiter mit B6D2F1-Mäusen (CLEA Japan, Tokio, Japan) gekreuzt, um Mäuse zu erhalten, die heterozygot für das RhoA-floxed-Allel waren. Die heterozygoten Mäuse wurden mindestens sechsmal auf den C57BL/6-Stamm zurückgekreuzt, und sowohl männliche als auch weibliche heterozygote Mäuse wurden gekreuzt, um Mäuse zu erhalten, die homozygot für das RhoA-floxed-Allel waren. Als nächstes wurden die homozygoten Mäuse mit transgenen Mäusen gepaart, die die vom SM22α-Promotor gesteuerte Cre-Rekombinase (SM22α-Cre) auf dem C57BL/6-Stamm exprimierten und vom Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) erworben wurden. Die Nachkommen mit sowohl heterozygotem RhoA-floxed-Allel als auch Cre-Gen wurden erneut mit den homozygoten RhoA-floxed-Mäusen gepaart, um VSMC-spezifische RhoA-cKO-Mäuse zu erzeugen. Als Kontrolle dienten Wurfgeschwistermäuse ohne das Cre-Gen. In dieser Studie wurden insgesamt 106 Mäuse (10–14 Wochen alte männliche Mäuse. Kontrolle n = 47; RhoA cKO n = 59) verwendet. Die Primer für die Genotypisierung zum Nachweis von Mäusen mit Cre- und RhoA-floxiertem Allel waren wie folgt: Cre, Forward 5'-ACCTCTGGGAACTGGTCCTT-3' und Reverse 5'-AGTTACCCCCAGGCTAAGTGC-3'; RhoA-gefloxt, vorwärts 5'-TCTTAACCGCTGAGGCCATCT-3′ und rückwärts 5′-ACCTCTGGGAACTGGTCCTT-3′.

Um AAA bei Mäusen zu induzieren, wurden AngII (1000 ng/kg/min) und BAPN (37,5 mg/kg/d) 4 Wochen lang mit osmotischen Minipumpen (ALZET Modell 1004; Durect Corp., Cupertino, CA, USA) verabreicht. wie zuvor beschrieben mit einigen Modifikationen49. Mäuse wurden mit Isofluran (1,0–1,5 %) anästhesiert. Zwei Minipumpen, gefüllt mit AngII und BAPN, gelöst in steriler Kochsalzlösung, wurden durch einen kleinen Einschnitt im Nacken in den subkutanen Raum implantiert. Als Kontrolle wurden nur mit Kochsalzlösung gefüllte Pumpen verwendet. Die Einschnittstellen wurden durch Naht verschlossen und heilten schnell und ohne Infektion. Bei einigen Mäusen wurde der MAP4K4-Inhibitor DMX-5804 (2,5 mg/kg), gelöst in 0,5 % Dimethylsulfoxid (DMSO), vier Wochen lang dreimal pro Woche intravenös über die Schwanzvene verabreicht. Aortendurchmesser sowie Herzkontraktilität und -dimensionen wurden unter Isofluran-Anästhesie (1,0–1,5 %) mittels Ultraschall (Vevo 2100; VisualSonics Inc., Toronto, Kanada) überwacht. Alle Tierversuche wurden vom Animal Care and Use Committee der Shiga University of Medical Science genehmigt und in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften, einschließlich der ARRIVE-Richtlinien (Animal Research Reporting of In Vivo Experiments), durchgeführt.

Der arterielle Blutdruck wurde wöchentlich bei wachen Mäusen unter Verwendung der plethysmographischen Schwanzmanschettenmethode (Modell BP-98-AL; Softron, Tokio, Japan) gemessen. Die Mäuse wurden vor und während der Blutdruckmessung mindestens 5–10 Minuten lang im zylindrischen Thermostat auf 37 °C erwärmt. Der Blutdruck wurde in 2-Minuten-Intervallen gemessen und der Mittelwert aus sieben Steady-State-Messungen wurde als Blutdruck bei jeder Maus verwendet50.

Mäuse wurden durch Zervixluxation eingeschläfert und die Aorta wurde nacheinander jeweils 5 Minuten lang mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und 10 % phosphatgepuffertem Formalin bei physiologischem Druck perfundiert. Die extrahierten Aortenproben von Mäusen und Menschen wurden 24 Stunden lang mit 10 % phosphatgepuffertem Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Es wurden Querschnitte (4 µm dick) angefertigt und entparaffiniert. Zur Bestimmung der Morphologie der Aorten wurde eine HE-Färbung durchgeführt. Für die Verhoeff-Van-Gieson-Färbung wurden formalinfixierte und entparaffinierte Schnitte 1 Stunde lang mit Verhoeff-Lösung inkubiert, mit Van-Gieson-Lösung gegengefärbt, schnell dehydriert und auf den Objektträger montiert. Der Abbau der medialen elastischen Lamina wurde anhand der Einstufung des Abbaus analysiert (kein Abbau, leichter Abbau, schwerer Abbau und Aortenruptur)51.

Detaillierte Informationen zu den in dieser Studie verwendeten Primärantikörpern sind in der Ergänzungstabelle 2 zusammengefasst.

Mit Formalin fixierte, in Paraffin eingebettete menschliche Aortenproben wurden geschnitten und entparaffiniert. Die Proben wurden 20–30 Minuten lang bei 90–100 °C in vorgewärmter Antigen-Retrieval-Lösung (1 mmol/L Zitronensäure, 0,05 % Tween 20 bei pH 6) eingeweicht und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die endogene Peroxidaseaktivität in allen Schnitten wurde mit 3 % Wasserstoffperoxidase gelöscht, und die Proben wurden dann mit 3 % Rinderserumalbumin (BSA) blockiert, bevor sie über Nacht mit einem Anti-RhoA-Antikörper inkubiert wurden. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Proben mit einem Biotin-konjugierten Sekundärantikörper (1:200-Verdünnung; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit Streptavidin-Peroxidase (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) für 30 Min. Der Avidin-Biotin-Komplex wurde mit dem Strep-ABC-Peroxidase-Kit (Nacalai Tesque) nachgewiesen. Die Proben wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt, gefolgt von Dehydrierungsschritten.

Kryoschnitte von Aortenproben von Menschen und Mäusen sowie Herzproben von erwachsenen Mäusen wurden 10 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixiert und dann dreimal jeweils 5 Minuten lang mit PBS gewaschen. Die Proben wurden 30 Minuten lang mit 0,2 % Triton Der mit Fluoreszenzfarbstoff markierte Sekundärantikörper (Alexa Fluor 488 und Alexa Fluor 555, 1:200–1000-Verdünnung, Thermo Fisher Scientific), Rhodamin-Phalloidin (1:600-Verdünnung, Thermo Fisher Scientific) und Alexa Fluor 488/647-Phalloidin (1 :600-Verdünnung, Thermo Fisher Scientific) wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur aufgetragen. Die Proben wurden dreimal jeweils 5 Minuten lang mit PBS gewaschen und dann mit Montagelösung mit DAPI zur Kernfärbung inkubiert (Dojindo, Kumamoto, Japan). Immunfluoreszenzbilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop (FV-1000; Olympus, Tokio, Japan oder Leica SP8; Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) aufgenommen.

Zur Färbung von Mäuseembryonen wurden die Embryonen bei E11,5 über Nacht bei 4 °C mit 100 % Methanol fixiert. Die Herzen wurden extrahiert und 30 Minuten lang bei 4 °C mit 50 % Methanol in PBS mit 0,5 % Triton X-100 (PBST) gewaschen, gefolgt von 30 Minuten langem Waschen mit PBST bei 4 °C. Die Proben wurden mit 1 % Milch in PBST 20 Minuten lang bei 4 °C blockiert und mit den primären Antikörpern für RhoA und die schwere Kette von α-Myosin (α-MHC) 48 Stunden lang bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurden sie dreimal mit PBST gewaschen und mit den mit Fluoreszenzfarbstoff markierten Sekundärantikörpern 48 Stunden lang bei 4 °C inkubiert. Abschließend wurden sie dreimal mit PBST gewaschen und zur optischen Reinigung mit Benzylalkohol:Benzylbenzoat (2:3)-Lösung inkubiert. Immunfluoreszenzbilder wurden mit dem konfokalen Leica SP8-Mikroskop aufgenommen.

Um die Spezifität von Antikörpern zu validieren, die zur Immunfärbung phosphorylierter (aktivierter) MAP-Kinase-Signalmoleküle verwendet werden, wurden RhoA-cKO-Mäusen nach der vierwöchigen Behandlung mit AngII und BAPN die folgenden Inhibitoren verabreicht: PD-98059 für den ERK-Inhibitor SB-203580 für den p38-Inhibitor und DMX-5804 für den MAP4K4-Inhibitor. Jeder Inhibitor wurde in 0,5 % DMSO gelöst und 100 µL der Inhibitorlösung (PD-98059: 10 mg/kg, SB-203580: 5 mg/kg und DMX-5804: 2,5 mg/kg) wurden intravenös durch injiziert Schwanzvene von RhoA-cKO-Mäusen. Das Lösungsmittel 0,5 % DMSO wurde anderen Mäusen als Vehikel intravenös injiziert. 30 Minuten nach der Injektion wurde die Aorta entnommen und die Gefrierschnitte für die Immunfärbung vorbereitet.

Die Gesamt-RNA wurde aus Aorten von Menschen und Mäusen sowie aus Maus-VSMCs unter Verwendung des TRIzol-RNA-Isolierungsreagenzes (Thermo Fisher Scientific) isoliert. cDNA wurde mit dem ReverTra Ace qPCR RT Master Mix mit gDNA Remover (Toyobo, Osaka, Japan) synthetisiert. Nach der reversen Transkription wurde eine quantitative Echtzeit-PCR mit dem LightCycler Instrument (Roche Diagnostics, Basel, Schweiz) durchgeführt. Die Echtzeit-PCR-Daten wurden mit der Standardkurvenmethode quantifiziert und das GAPDH-mRNA-Expressionsniveau von Mensch oder Maus diente als interne Kontrolle. Die Primer sind in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführt.

Das Expressionsplasmid des EGFP-markierten RhoA-WT wurde zuvor hergestellt52. cDNAs der Maus-Set-Isoform 1 (Set1) und Isoform 2 (Set2) wurden durch Reverse-Transkriptions-PCR unter Verwendung von RNA erhalten, die aus Maus-Aorten-VSMCs extrahiert wurde. Die Primer zur Amplifikation der cDNAs waren wie folgt: Set1, Forward 5'-GGGGAATTCGCCCCGAAGCGGCAGTCTGCGAT-3' und Reverse 5'-GGGCTCGAGCTAATCATCCTCGCCTTCGTCCTCCT-3'; Set2, Vorwärts 5′-GGGGAATTCTCTGCGCCGACGGCCAAAGCCAG-3′ und Rückwärts 5′-GGGCTCGAGCTAATCATCCTCGCCTTCGTCCTCCT-3′. Jede cDNA wurde in das pCMV-HA-Expressionsplasmid (Takara Bio, Kusatsu, Japan) subkloniert, indem sie mit den Restriktionsenzymen EcoRI und XhoI verdaut und mit Ligation High Ver.2 (Toyobo, Osaka, Japan) ligiert wurde. Die Sequenzen der in das Plasmid eingefügten cDNAs wurden mit dem Prism 3100xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA) bestätigt.

Die Aorten von Menschen und Mäusen sowie die Herzen von Mäusen wurden mechanisch in RIPA-Puffer (Radioimmunpräzipitationsassay) (50 mmol/l Tris-HCl [pH 7,5], 150 mmol/l NaCl, 0,5 % Natriumdesoxycholat, 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS)) homogenisiert. , 1 % Nonidet P-40, 1 μg/ml Aprotinin, 1 μg/ml Leupeptin, 1 mmol/L Phenylmethylsulfonylfluorid, 5 mmol/L Natriumfluorid und 1 mmol/L Natriumorthovanadat). VSMCs wurden auch in RIPA-Puffer lysiert. Die Lysate wurden 15 Minuten lang bei 14.000 U/min zentrifugiert und der Überstand für weitere Experimente verwendet. Proteinproben wurden durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) aufgetrennt und auf eine Polyvinylidendifluoridmembran (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) übertragen. Die Membran wurde dann 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in 5 % BSA oder 5 % Magermilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20 blockiert. Die Membran wurde mit Primärantikörper über Nacht in 5 % Magermilch bei 4 °C inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit Meerrettichperoxidase (HRP)-markiertem Sekundärantikörper (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) für 1 Stunde in 5 % Magermilch. Die Membran wurde 5 Minuten lang mit HRP-Substrat (Luminata Forte, Millipore Corp., Billerica, MA, USA) inkubiert und auf einem Lumineszenzbildanalysator LAS-4000 (Fujifilm Life Science, Tokio, Japan) beobachtet. Die Bandendichten wurden mit der ImageJ-Software analysiert.

Schnappgefrorene Aortenproben von Kontroll- und RhoA-cKO-Mäusen wurden pulverisiert und einmal mit PBS 30 Minuten lang bei 4 °C gewaschen. Ein Aliquot der Probe wurde ohne Pepsinverdau in ein neues Röhrchen überführt, um den Gesamtkollagengehalt zur Bewertung der Kollagensynthese zu bestimmen. Nach 30-minütiger Zentrifugation bei 16.000 × g und 4 °C wurden die ausgefällten Proben 16 Stunden lang bei 4 °C und sanfter Rotation in 0,5 mol/l Essigsäure mit 1 mg/ml Pepsin verdaut. Die unverdauten Proben wurden durch 30-minütige Zentrifugation bei 16.000 × g und 4 °C zusammengesetzt und als vernetztes Kollagen gesammelt. Der Überstand wurde als nicht vernetztes Kollagen gesammelt und anschließend 30 Minuten lang in 2 mol/l NaCl ausgefällt, gefolgt von einer 30-minütigen Zentrifugation bei 16.000 × g bei 4 °C. Das gesamte, vernetzte und nicht vernetzte Kollagen wurde mit dem Hydroxyprolin-Assay53 quantifiziert, der mit dem Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) durchgeführt wurde. Die Ergebnisse werden in Mikrogramm Hydroxyprolin pro Milligramm Nassgewebegewicht angegeben.

Um primäre Aorten-VSMCs von Mäusen zu isolieren, wurde die gesamte Aorta von RhoA-cKO- und Kontrollmäusen extrahiert, in kleine Stücke geschnitten und mit Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) inkubiert, das Kollagenase Typ I (Sigma-Aldrich) und Elastase (Sigma-Aldrich) enthielt. und Trypsininhibitor (Thermo Fisher Scientific) für 3–4 Stunden bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre aus 5 % CO2 und 95 % Luft54. VSMCs wurden in DMEM mit 10 % FBS kultiviert. Für Experimente wurden VSMCs der Passagen 4 bis 7 bei 70–80 % Konfluenz verwendet. Die Eigenschaften der VSMC-Populationen wurden durch Immunfluoreszenzfärbung für α-SMA (Santa Cruz Biotechnology) bestätigt. Für In-vitro-Experimente wurden die Zellen mit Kochsalzlösung, 1 µmol/L AngII und/oder 10 µmol/L DMX-5804 (Selleck, Houston, TX, USA) behandelt.

Plasmid-DNA wurde mit dem Neon Transfection System (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) in VSMCs eingeführt. Nach dem Waschen der Zellen mit PBS wurden die Zellen (1 × 107 Zellen/100 μL) in Puffer R resuspendiert und mit 500 ng jedes Plasmids gemischt. Die Plasmid-Einführungsparameter waren wie folgt: Impulsspannung 1200 V, Impulsbreite 20 ms und Impulszahl 2.

Die isolierte Mausaorta wurde in runde Scheiben (ca. 2 mm Breite) geschnitten und in einem mit Krebs gefüllten Bad am Draht eines Myographen (Multi Wire Myograph System-Modell 620 M; Danish Myo Technology, Aarhus, Dänemark) befestigt. Lösung (118 mmol/L NaCl, 25 mmol/L NaHCO3, 11 mmol/L Glucose, 4,7 mmol/L KCl, 1,17 mmol/L MgSO4, 1,2 mmol/L KH2PO4, 2,5 mmol/L CaCl2 bei 37 °C), kontinuierlich mit 95 % O2 und 5 % CO2 gesprudelt. Die Aorta wurde in diesem Zustand 5 Minuten lang in den Ruhezustand gebracht. Die Aortenspannung der Maus wurde mit dem Multi Wire Myograph System55 gemessen. Die erhaltenen Drücke wurden mit der LabChart 8-Software (ADInstruments Inc., Colorado Springs, CO, USA) überwacht und aufgezeichnet.

Typ-I-Kollagenlösung aus Schweinesehnen (Nitta Gelatin, Osaka, Japan), DMEM (zweimal konzentriert), Rekonstitutionspuffer (50 mmol/L NaOH, 260 mmol/L NaHCO3, 200 mmol/L HEPES) und in DMEM suspendierte VSMCs wurden auf Eis im Verhältnis 7:2:1:1 gemischt. Als nächstes wurde ein Tropfen (30–50 μl) der gemischten Lösung (4 × 105 Zellen/ml) auf ein silikonisiertes Deckglas in einer 6-Well-Platte gegeben. Die Platte wurde 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, um das Gel auszuhärten, und 2 ml DMEM mit 10 % FBS mit AngII (Endkonzentration 10 μmol/l) oder Kochsalzlösung wurden dem Gel zugesetzt. Die Zellen wurden 24 Stunden lang bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre aus 5 % CO2 und 95 % Luft kultiviert. Nach der Kultur wurde das Medium aus jeder Vertiefung entfernt und das Gel vorsichtig aus der Vertiefung gelöst. Anschließend wurde der Geldurchmesser nach 0, 6, 12, 24 und 48 Stunden gemessen, um die Kontraktilität isolierter VSMCs56 zu messen.

Die mit der endothelialen Barrierefunktion in der Aorta verbundene Gefäßpermeabilität wurde durch das Verfahren unter Verwendung des Evans Blue-Farbstoffs57 bestimmt. Einhundert μl 1 % Evans Blue-Farbstoff (Nacalai Tesque), gelöst in Kochsalzlösung, wurden Mäusen intravenös injiziert. 10 Minuten nach der Injektion wurden die Mäuse eingeschläfert und die Aorta entnommen, gefolgt von der Fixierung mit 10 %iger Formalinlösung. Zur Aufnahme von Bildern wurde die Aorta unter einem Lichtmikroskop untersucht. Der mit Evans Blue-Farbstoff gefärbte Bereich wurde gemessen, um die Schädigung der Endothelschicht zu bewerten.

Lysierte menschliche Aortenproben wurden mit 5x nicht reduzierendem Probenpuffer (312,5 mmol/L Tris-HCl [pH 6,8], 11,5 % SDS, 40 % Glycerin) gemischt und auf ein 7,5 % SDS-PAGE-Gel mit 4 mg/ml geladen Gelatine. Nach der SDS-PAGE wurde das Gel zweimal mit Waschpuffer (50 mmol/L Tris-HCl [pH 7,5], 2,5 % Triton X-100, 5 mmol/L CaCl2, 1 µmol/L ZnCl2) bei 37 °C gewaschen Jeweils 30 Minuten lang und dann in Inkubationspuffer (50 mmol/L Tris-HCl [pH 7,5], 1 % Triton X-100, 5 mmol/L CaCl2, 1 µmol/L ZnCl2) für 10 Minuten unter leichtem Rühren inkubiert Anschließend erfolgt der Ersatz durch frischen Inkubationspuffer und die Inkubation für 24 Stunden bei 37 °C. Nach der Färbung mit Coomassie Brilliant Blue (CBB; Nacalai Tesque) waren Bereiche mit Gelatineabbau als klare und scharfe Banden vor einem blauen Hintergrund des nicht abgebauten Substrats sichtbar. Die Bandendichten wurden mit der ImageJ-Software (National Institute of Health, Bethesda, MD, USA) analysiert.

Die Lysate von Aorten-VSMCs wurden mit Protein-G-Sepharose-Kügelchen (GE Healthcare) vorgereinigt, um Proteine ​​zu entfernen, die unspezifisch an die Kügelchen binden. Nach der Zentrifugation wurden die Überstände mit dem angegebenen Primärantikörper (1:100-Verdünnung) über Nacht bei 4 °C inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit Protein-G-Sepharose-Kügelchen für 2 Stunden bei 4 °C. Die Proben wurden 1 Minute lang bei 4 ° C und 3000 × g zentrifugiert und die Perlen wurden dreimal mit RIPA-Puffer gewaschen. An die Perlen gebundene Proteine ​​wurden in 2x Probenladepuffer eluiert und im Western Blot verwendet.

Für die LC-MS/MS-Analyse wurde das Gel über Nacht mit CBB gefärbt und die spezifischen Proteinbanden in der GFP-RhoA-WT-Spur wurden nach dem Entfärben herausgeschnitten. Die Gelscheiben wurden zur vollständigen Entfärbung von CBB in 50 % Acetonitril und 50 mmol/L Ammoniumbicarbonatlösung eingeweicht. Nach dem Waschen mit entionisiertem Wasser wurden die Scheiben 15 Minuten lang in 100 % Acetonitril eingeweicht und mit Savant SpeedVac (Thermo Fisher Scientific) vollständig getrocknet. Proteine ​​in den Gelscheiben wurden mit 800 ng/40 μl Trypsin:Lysyl-Endopeptidase-Mischung (1:1) bei 37 °C 16 Stunden lang verdaut. Die verdauten Peptidproben wurden in ein neues Röhrchen überführt und mit C18-StageTip (Thermo Fisher Scientific) entsalzt. Nachdem die Proben mit Savant SpeedVac getrocknet wurden, wurden 10 μl einer 0,1 % Ameisensäure/3 % Acetonitril-Lösung hinzugefügt, um die Peptide für die nächste Anwendung zu solubilisieren.

Für die LC wurden 2 μl der Probe auf den Nanoflow UPLC (UltiMate 3000 RSLCnano LC System, Thermo Fisher Scientific) aufgetragen, der mit einer Nanosäule (75 μm × 125 mm Säule, gefüllt mit einem Umkehrphasen-ReproSil-Pur C18-AQ-Harz) ausgestattet war; Nikkyo Technos Co., Ltd, Tokio, Japan) bei 40 °C. Das Gradientenelutionsprogramm mit mobiler Phase A (0,1 % Ameisensäure in Wasser) und mobiler Phase B (0,1 % Ameisensäure in 80 % Acetonitril) wurde zur Trennung absorbierter Peptide durchgeführt: Phase B, 2 %–8 % für 0–4 Min., 8 %–30 % für 4–26 Min., 30 %–65 % für 26–34 Min. Anschließend wurde eine Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) unter Verwendung der Orbitrap Q Exactive HF-X-Massenspektrometrie (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt. Die Elektrospray-Ionisationsquelle wurde im positiven Ionenmodus betrieben, die Spannung war auf 1,7 kV eingestellt und die Ionentransferkapillare war auf 275 °C eingestellt. MS1-Spektren wurden im Bereich von 380 bis 1240 m/z bei einer Auflösung von 60.000 gesammelt, um ein AGC-Ziel von 3 × 106 zu treffen. Die besten 40 Vorläuferionen mit Ladungszuständen von 2+ bis 5+ wurden für die Fragmentierung mit abgestufter normalisierter Kollisionsenergie ausgewählt von 22 %, 26 % und 30 %. MS2-Spektren wurden mit einer Auflösung von 15.000 gesammelt, um ein AGC-Ziel von 1 × 105 zu erreichen. Die dynamische Ausschlusszeit wurde auf 12 s eingestellt. Die Verarbeitung der Rohdaten und die Analyse durch Datenbanksuchen wurden mit PEAKS STUDIO Desktop Version . Die Parameter der Software wurden wie folgt eingestellt: Oxidation (+15,99 Da) (Methioninreste) wurde als variable Modifikation von Proteinen eingestellt; Trypsinspaltungen waren erlaubt; die Vorläuferionen-Massentoleranz wurde auf ±10,0 ppm und die MS/MS-Toleranz auf 0,015 Da eingestellt; Der Proteinidentifizierungsschwellenwert wurde sowohl für die Peptid- als auch für die Protein-Falscherkennungsrate auf <1 % festgelegt. Um die Falscherkennungsrate in der PEAKS Studio-Software abzuschätzen, wurde die Decoy-Fusion-Methode angewendet. Die Proteomanalyse wurde vom Kazusa DNA Research Institute (Kisarazu, Japan) durchgeführt. Die PSOPIA-Software (National Institute of Biomedical Innovation, Health and Nutrition, Ibaraki, Japan) wurde für die In-silico-Analyse verwendet, um die Proteine ​​zu identifizieren, die mit Komponenten des STRIPAK-Komplexes interagieren können, der die MAP4K4-Aktivität moduliert.

Aktives GTP-gebundenes RhoA wurde durch Pulldown-Assay wie zuvor beschrieben mit einigen Modifikationen nachgewiesen52. Kurz gesagt, die Zellen wurden im Zelllysepuffer (50 mmol/L Tris/HCl [pH 7,5], 0,5 Mol/L NaCl, 10 mmol/L MgCl2, 1 % Triton X-100) lysiert. Der Zellextrakt wurde durch Zentrifugation erhalten und dann mit Glutathion-S-Transferase, fusioniert mit der mDia-Rho-Bindungsdomäne, konjugiert mit Glutathion-Sepharose-Kügelchen (GE Healthcare), über Nacht bei 4 °C inkubiert, um GTP-gebundenes RhoA zu sammeln. Nachdem die Perlen mit dem Zelllysepuffer gewaschen wurden, wurden die an die Perlen gebundenen Proteine ​​mit SDS-Probenpuffer eluiert und einer SDS-PAGE unterzogen, gefolgt von einem Western-Blot mit Anti-RhoA-Antikörper. Das aktive GTP-interagierende Protein Set wurde auch durch einen Anti-Set-Antikörper nachgewiesen.

Set-siRNA und Negativkontroll-RNA (Scramble) wurden unter Verwendung des CUGA7-In-vitro-Transkriptionskits (Nippon Gene, Tokio, Japan) hergestellt. Die siRNA-Sequenzen sind wie folgt: Set siRNA 5′-GGATGAAGGTGAAGAAGAT-3′ und Scramble 5′-CAGTCGCGTTTGCGACTGG-3′. Die siRNA-Transfektion wurde mit dem Transfektionsreagenz Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) durchgeführt.

Alle Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) ausgedrückt. Alle Experimente wurden mindestens dreimal unabhängig voneinander durchgeführt. Die statistische Analyse wurde mit der Prism 9-Software (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) durchgeführt. Statistische Unterschiede zwischen Versuchsgruppen wurden durch den exakten Fisher-Test, den zweiseitigen Student-t-Test, die einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) oder die zweifaktorielle ANOVA mit wiederholten Messungen bewertet. Wenn die ANOVA eine Gesamtsignifikanz anzeigte, wurden die individuellen Unterschiede mithilfe des Bonferroni-Posttests bewertet. p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Unbeschnittene Western-Blot-Bilder sind in den ergänzenden Abbildungen dargestellt. 11–14, und alle Quelldaten, die den Diagrammen in den Hauptabbildungen zugrunde liegen, sind in den Zusatzdaten 2 aufgeführt. Neu generierte Plasmide in dieser Studie werden bei Addgene (https://www.addgene.org/) mit der Hinterlegungs-ID-Nummer 81677 hinterlegt . Massenspektrometrie-basierte Proteomikdaten werden beim ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) über das PRIDE-Partner-Repository mit der Datensatzkennung PXD03682558 hinterlegt. Alle anderen während dieser Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Wir danken Herrn Takefumi Yamamoto vom Central Research Laboratory und Prof. Eiichiro Nishi vom Department of Pharmacology der Shiga University of Medical Science für ihre hervorragende technische Unterstützung bei dieser Studie. Diese Studie wurde teilweise durch Zuschüsse für wissenschaftliche Forschung der Japan Society for the Promotion of Science für A. Shimizu [21K06854], MK [21K16086], A. Sato [21K09419] und HO [17K08627] unterstützt und 20K08489]; Takeda Science Foundation, The Naito Foundation, SENSHIN Medical Research Foundation und Uehara Memorial Foundation für HO

Abteilung für molekulare medizinische Biochemie, Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie, Shiga University of Medical Science, Otsu, Japan

Md Russell Molla, Akio Shimizu, Masahiro Komeno, Nor Idayu A. Rahman, Joanne Ern Chi Soh, Le Kim Chi Nguyen, Mahbubur Rahman Khan, Wondwossen Wale Tesega, Si Chen, Xiaoling Pang, Akira Sato und Hisakazu Ogita

Abteilung für Notaufnahme, Viertes angegliedertes Krankenhaus der China Medical University, Shenyang, China

Si Chen & Xiaoling Pang

Abteilung für Molekularbiologie, Osaka International Cancer Institute, Osaka, Japan

Miki Tanaka-Okamoto

Abteilung für Herz-Kreislauf-Chirurgie und Thoraxchirurgie, Abteilung für Chirurgie, Shiga University of Medical Science, Otsu, Japan

Noriyuki Takashima & Tomoaki Suzuki

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Entwerfen von Forschungsstudien (MRM, A.Shimizu und HO), Durchführen von Experimenten und Erfassen von Daten (MRM, A.Shimizu, MK, NIAR, JECS, LKCN, MRK, WWT, SC, XP, MT-O. und A. Sato), Analyse von Daten (MRM, A.Shimizu, NT, TS und HO), Bereitstellung von Proben (MT-O., NT und TS) und Schreiben des Manuskripts (MRM, A.Shimizu und HO).

Korrespondenz mit Hisakazu Ogita.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Toshiro Moroishi und Manuel Breuer. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Molla, MR, Shimizu, A., Komeno, M. et al. RhoA der glatten Gefäßmuskulatur wirkt der Bildung eines Bauchaortenaneurysmas entgegen, indem es die MAP4K4-Aktivität moduliert. Commun Biol 5, 1071 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04042-z

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Eingegangen: 08. April 2022

Angenommen: 27. September 2022

Veröffentlicht: 07. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04042-z

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