Verbesserte angiogene Eigenschaften von Nabelschnurblut, das durch OP9-Stromazellen vorbereitet wurde, verbessern neurologische Defizite im Mausmodell mit Hirninfarkt

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 262 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Transplantation von Nabelschnurblut (UCB) zeigt proangiogene Wirkungen und trägt zur Symptomlinderung in Tiermodellen von Hirninfarkten bei. Allerdings sind die Auswirkungen bestimmter Zelltypen innerhalb einer heterogenen UCB-Population immer noch umstritten. OP9 ist eine Stromazelllinie, die als Feederzellen zur Förderung der hämatoendothelialen Differenzierung embryonaler Stammzellen verwendet wird. Daher untersuchten wir die Veränderungen der angiogenen Eigenschaften, die zugrunde liegenden Mechanismen und die Auswirkungen auf Verhaltensstörungen, die durch einen Hirninfarkt in UCB verursacht wurden, das bis zu 24 Stunden lang mit OP9 kokultiviert wurde. Im Netzwerkbildungstest bildete nur OP9-vorkonditioniertes UCB Netzwerkstrukturen. Einzelzell-RNA-Sequenzierung und Durchflusszytometrieanalyse zeigten eine deutliche phänotypische Verschiebung in Richtung M2 in der Monozytenfraktion von OP9-vorkonditioniertem UCB. Darüber hinaus erleichterte die OP9-vorkonditionierte UCB-Transplantation in Mäusemodellen für Hirninfarkt die Angiogenese in den Periinfarktläsionen und linderte die damit verbundenen Symptome. In dieser Studie haben wir eine starke, schnelle und praktikable Methode entwickelt, um die M2, gewebeschützenden, proangiogenen Eigenschaften von UCB mithilfe von OP9 zu verbessern. Die verbessernde Wirkung von OP9-vorkonditioniertem UCB in vivo könnte teilweise auf die Förderung der angeborenen Angiogenese in Periinfarktläsionen zurückzuführen sein.

Ein Hirninfarkt ist eine der Hauptursachen für bleibende Beeinträchtigungen und den Tod. Derzeit werden in der akuten Phase häufig intravenöse Thrombolytika und eine endovaskuläre Rekanalisationstherapie eingesetzt, um eine ischämische Penumbra zu verhindern. Allerdings haben diese Therapien enge Zeitfenster und die therapeutischen Indikationen sind auf eine bestimmte Patientengruppe beschränkt1. Daher sind therapeutische Innovationen bei Hirninfarkten notwendig und äußerst anspruchsvoll.

Verglichen mit konventionellen Reperfusionstherapien geht man neuerdings davon aus, dass die Zelltherapie in Zukunft eine breiter anwendbare Therapie bei Hirninfarkten sein wird2, da sie das Potenzial hat, die damit verbundenen Symptome zu lindern, selbst wenn sie in der subakuten oder chronischen Phase verabreicht wird3.

Frühere Studien haben gezeigt, dass Nabelschnurblut (UCB) und peripheres Blut (PB) von Erwachsenen einen bestimmten mononukleären Anteil enthalten, der sich an den Stellen der aktiven Angiogenese ansammeln und zur Neovaskularisation beitragen kann4,5. Asahara et al. beschrieb erstmals, dass eine Population hämatopoetischer CD34+-Zellen, die aus von menschlichen PB abgeleiteten mononukleären Zellen (PB-MNCs) sortiert wurde, durch Ausplattieren auf mit Fibronektin beschichteten Schalen spindelförmige Zellen mit dem universellen hämatopoetischen Marker CD45 ergeben und die Neovaskularisation in einem Ischämiemodell der Hinterbeine fördern könnte6 . Ähnliche Ergebnisse wurden von Kalka et al. berichtet. Verwendung primär adhärenter mononukleärer Zellen ohne CD34-Sortierung7.

Seitdem wurde die proangiogene Zellpopulation innerhalb der heterogenen Population mononukleärer Zellfraktionen umfassend untersucht. Es wurde gezeigt, dass CD14+CD45+-monozytische Zellen in CD34+CD45+-hämatopoetischen Vorläufern in UCB oder PB Zellcluster bilden, die denen von Asahara8 ähneln, wohingegen einige andere Studien berichteten, dass die CD34-CD14+-monozytenfraktion von PB ähnliche Merkmale aufwies9,10. Mittlerweile wurde gezeigt, dass eine Population proangiogener Zellen von myeloischen Vorläufern und Granulozyten-Makrophagen-Vorläufern stammt11. Diese Ergebnisse stimmen mit der bekannten Annahme überein, dass Monozyten eine Reihe unterschiedlicher funktioneller Phänotypen aufweisen (d. h. M1 und M2) und dass M2-Monozyten mit der Angiogenese12 sowie der Förderung der Neurogenese, der Axonbildung und der Remyelinisierung13 assoziiert sind, während M1 Monozyten sind entzündungsfördernd und vermitteln Gewebeschäden.

Tatsächlich wurde gezeigt, dass solche Zellfraktionen die Revaskularisierung von ischämischen Geweben wie ischämischen Hinterbeinen und bei Myokardinfarkten erleichtern14,15. Darüber hinaus ist bekannt, dass die Angiogenese positiv mit der neurologischen Erholung nach einem Hirninfarkt korreliert16. Mehrere Studien zeigten, dass die UCB-Transplantation proangiogene Wirkungen zeigte und zu einer Verringerung des ischämischen Volumens oder einer Symptomverbesserung in Tiermodellen für Hirninfarkte beitrug17,18,19. Allerdings verwendeten die meisten dieser Studien rohe UCB-17,19,20 oder von UCB abgeleitete mononukleäre Zellen18,21, ähnlich denen, die von Kalka et al. beschrieben wurden. Darüber hinaus ist die Wirksamkeit von CD34+-Zellen, die aus UCB-abgeleiteten mononukleären Zellen6 sortiert wurden, in einem Modell eines Hirninfarkts umstritten21,22.

Diese Ergebnisse führten uns zu der Hypothese, dass die Vergrößerung spezifischerer proangiogener Zellpopulationen in UCB zu verstärkten therapeutischen Wirkungen führt. Basierend auf dieser Hypothese konzentrierten wir uns auf die Merkmale von OP9, einer Stromazelllinie, die ursprünglich als Feederzelllinie zur Förderung der erythroiden, myeloischen und lymphoiden Differenzierung embryonaler Stammzellen verwendet wurde23. Es ist auch bekannt, dass es die Differenzierung in endotheliale und hämatopoetische Zellen aus einer Zellpopulation erleichtert, die aus der intraembryonalen hämatopoetischen Stelle vor der Leber stammt24. Darüber hinaus wurde kürzlich in mehreren Organen über eine bestimmte endotheliale Vorläuferzellpopulation berichtet, die von der Innenoberfläche von Blutgefäßen stammt. OP9 förderte effektiv deren Expansion, Koloniebildung und Differenzierung in reife Endothelzellen25. Daher könnte OP9 geeignet sein, die angiogenen Eigenschaften von UCB zu verbessern.

In dieser Studie haben wir eine neue Kulturmethode für mit OP9 vorbereitete UCB-Zellen etabliert. Wir untersuchten, ob diese „Vorkonditionierungs“-Methode von UCB seine angiogenen Eigenschaften verbessern könnte, und um die zugrunde liegenden Mechanismen und den Einfluss von OP9-vorkonditioniertem UCB auf Verhaltensdefizite zu identifizieren, die durch einen experimentellen fokalen Hirninfarkt in einem Mausmodell unter Verwendung chirurgischer Okklusion verursacht wurden der mittleren Hirnarterie (MCAO).

In-vitro-Netzwerkbildungstests auf Matrigel werden seit langem verwendet, um die proangiogene Kapazität kultivierter Zellen zu bewerten5,8,10,26,27,28,29. Um die proangiogenen Eigenschaften von UCB-Zellen zu bewerten, führten wir den Test mit PB-MNCs, UCB-Zellen und OP9-vorkonditionierten UCB-Zellen durch (Abb. 1a). Überraschenderweise bildeten OP9-vorkonditionierte UCB-Zellen nach einer kurzen Kokultur innerhalb von 24 Stunden kapillarähnliche Strukturen, wohingegen solche Strukturen in UCB-Zellen ohne Vorkonditionierung nicht beobachtet wurden (Abb. 2a, b). Bei Inkubation mit menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) bildeten OP9-vorkonditionierte UCB-Zellen dicke und feste Netzwerkstrukturen, die heterogen mit HUVECs ausgerichtet waren, wohingegen UCB-Zellen ohne OP9-Vorkonditionierung keine solche strukturelle Ausrichtung mit HUVECs bildeten (Abb. 2c). ,D). Im Vergleich zu OP9-vorkonditionierten UCB-Zellen bildeten HUVECs auch selbst eine dünne und schwache Netzwerkstruktur (Abb. 2e). Als Kontrollen wurden PB-MNCs verwendet, die auch nach OP9-Vorkonditionierung keine kapillarähnlichen Strukturen mit HUVECs bildeten (Abb. 2f). OP9-Zellen allein bildeten keine kapillarähnlichen Strukturen (Daten nicht gezeigt).

Methodische schematische Darstellungen zur Studie. (a) Protokoll für den Netzwerkbildungstest. RBC-abgereicherte menschliche Nabelschnurblutzellen (UCB) und aus peripherem Blut stammende mononukleäre Zellen (PB-MNCs) wurden auf OP9-Stromazellen (d. h. OP9-Vorkonditionierung) in 10-cm-Schalen co-kultiviert. Nach einer 18–24-stündigen Kultur wurden die anhaftenden Zellen geerntet und einem In-vitro-Netzwerkbildungstest unterzogen. Als Kontrolle dienten RBC-arme UCB-Rohzellen und PB-MNCs, die auf Fibronektin-beschichteten Schalen kultiviert wurden. (b) Protokoll für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) und Durchflusszytometrie. Als Kontrolle wurden RBC-arme UCB-Rohzellen verwendet. (c) Protokoll für die intravenöse Verabreichung von OP9-vorkonditioniertem UCB im MCAO-Mausmodell. Mäuse wurden wie folgt zufällig drei Gruppen zugeteilt: der UCB + OP9-Gruppe (n = 11); die Kontrollgruppe (n = 11); und die Gruppe mit Scheinoperationen (n = 12) und unterzog sich einer MCAO- oder Scheinoperation. Zwei Wochen nach der Operation erhielten Mäuse in der UCB + OP9-Gruppe 100 μl OP9-vorkonditioniertes UCB (2,0 × 107 Zellen/kg) und Mäuse in der Kontrollgruppe erhielten die gleiche Menge Ringer-Laktat-Lösung intravenös (iv.). Einen Monat nach der Zelltransplantation wurde eine Reihe von Verhaltenstests durchgeführt, und drei Monate nach der Zelltransplantation wurden fünf Mäuse in der UCB + OP9-Gruppe und fünf Mäuse in der Kontrollgruppe zufällig ausgewählt und der Immunhistochemie unterzogen.

In-vitro-Netzwerkbildungstest unter Verwendung von UCB- oder PB-MNC-abgeleiteten adhärenten Zellen mit oder ohne OP9-Vorkonditionierung. Die Panelnamen von (a–f) sind identisch mit denen von (a–f) in Abb. 1a. Von UCB oder PB-MNC abgeleitete adhärente Zellen mit oder ohne OP9-Vorkonditionierung wurden auf Matrigel ausgesät. In den Feldern (c)–(f) wurden menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) hinzugefügt. (a) OP9-vorkonditionierte UCB-Zellen mit kapillarähnlichen Strukturen. (b) UCB-Zellen ohne OP9-Vorkonditionierung. (c) OP9-vorkonditionierte UCB-Zellen mit HUVECs. (d) HUVECs und UCB-Zellen ohne OP9-Vorkonditionierung. (e) HUVECs allein (ohne OP9-Vorkonditionierung). (f) OP9-vorkonditionierte PB-MNCs, die gemeinsam mit HUVECs kultiviert wurden. Maßstabsleiste: 100 μm, 10-fache Vergrößerung.

Daher verstärkte die OP9-Vorkonditionierung die proangiogenen Eigenschaften von UCB-Zellen innerhalb von 24 Stunden, die in PB-MNCs nicht induziert wurden.

UCB-Zellen enthalten heterogene Zellpopulationen, daher ist es notwendig, die Zelltypen zu klären, die von der OP9-Vorkonditionierung betroffen sind. Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) wurde verwendet, um Änderungen im genetischen Expressionsprofil jeder Zellpopulation zu bewerten, wobei wir sowohl vorkonditionierte OP9- als auch rohe UCB-Zellen verglichen (ergänzende Abbildung 1). Unüberwachtes Clustering mittels t-verteilter stochastischer Nachbareinbettung (tSNE) wurde eingesetzt, um alle UCB-Zellen in transkriptionell unterschiedlichen Clustern zu organisieren und die unterschiedlich exprimierten Markergene in jedem Cluster zu identifizieren. Es entstanden insgesamt 25 stabile Cluster, darunter Cluster aus Monozyten, Granulozyten, hämatopoetischen Stammzellen und gemeinsamen myeloischen und Granulozyten-Makrophagen-Vorläufern (CMP/GMPs), von denen bekannt ist, dass sie proangiogene Wirkungen haben (ergänzende Abbildung 1). Eine Liste der Gene, die in jedem Zelltyp bevorzugt exprimiert werden, finden Sie in den Zusatzdaten. Ein Geigendiagramm und eine Genexpressionsverteilungskarte von CD14 und CGR3A, Gene, von denen angenommen wird, dass sie bevorzugt in Monozyten exprimiert werden, ließen darauf schließen, dass die Zellen in Cluster 4 hauptsächlich aus Monozyten bestanden (ergänzende Abbildung 1). Der Monozytenanteil war in OP9-vorkonditionierten UCB-Zellen deutlich höher als in den rohen UCB-Zellen (8,0 % vs. 5,3 %), wohingegen sich die Zellzahl von hämatopoetischen Stammzellen und CMP/GMPs nicht veränderte (0,6 % vs. 1,1). % bzw. 0,6 % vs. 0,4 %) (Ergänzende Abbildung 1).

M1-Phänotyp-Monozyten sind entzündungsfördernd und vermitteln Gewebeschäden, während der M2-Phänotyp mit Angiogenese assoziiert ist. Daher haben wir uns auf die Genexpressionsmerkmale des Monozytenclusters konzentriert. Die Heatmaps typischer M1- und M2-Signaturgene zeigten eine klare Tendenz des Genexpressionsprofils, wobei die M2-Markergene, wie Makrophagen-Aktivierungsfaktor (MAF) und CD163, reichlich im Monozytencluster von OP9-vorkonditioniertem UCB exprimiert wurden. während die M1-spezifische Genexpression bei rohem UCB höher war (Abb. 3a). Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Monozytencluster von OP9-vorkonditioniertem UCB im Vergleich zu dem von rohem UCB in Richtung des M2-Phänotyps verschoben war.

Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) und Durchflusszytometrieanalyse von rohen UCB- und OP9-vorkonditionierten UCB-Zellen. (a) Heatmaps typischer M1- und M2-Signaturgene. Die rechte Seitenleiste zeigt die Signaturgene M1 und M2 in Blau bzw. Rot. Der Maßstabsbalken zeigt die Genexpressionsniveaus an, die aus logarithmisch normalisierten UMI-Zählungen (Unique Molecular Index) berechnet wurden (Skalierungsfaktor = 10.000). (b) Genontologie (GO)-Anreicherungsanalyse unterschiedlich exprimierter Gene zwischen rohem UCB und UCB + OP9. Angereicherte GO-Terme wurden auf der Grundlage des hypergeometrischen Tests identifiziert und angepasste p-Werte wurden mit der Methode von Benjamini und Hochberg (BH) abgeleitet. Die 15 am häufigsten angereicherten GO-Begriffe wurden gemäß dem p-Wert von –log10 angezeigt. (c, d) Durchflusszytometrieanalyse von UCB und UCB + OP9. Die Lebensfähigkeit der Zellen (das Verhältnis lebender Zellen zu allen Ereignissen) wurde mittels DAPI-Färbung analysiert. Zellen in der Monozytenfraktion (P1-Population) wurden basierend auf den Eigenschaften der Vorwärtswinkel-Lichtstreuung (FSC) und der Seitenwinkel-Lichtstreuung (SSC) erfasst. Anschließend wurden CD80 und CD206 verwendet, um Zellen vom Typ M1 und M2 in die Quadranten Q4 bzw. Q1 zu sortieren.

Darüber hinaus ergab die Genontologie (GO)-Analyse unterschiedlich exprimierter Gene zwischen dem monozytären Cluster von vorkonditioniertem OP9 und rohem UCB charakteristische Trends der GO-Terminbereicherung. GO-Begriffe im Zusammenhang mit Hypoxie, Glykolyse und oxidativen Wegen wiesen die höchsten Anreicherungs-p-Werte auf (Abb. 3b). Diese Ergebnisse stimmen mit den Ergebnissen von Heatmaps in Bezug auf intrazelluläre Stoffwechselveränderungen überein, wenn man bedenkt, dass Hypoxie Monozyten in Richtung des M1-Phänotyps verschiebt, bei dem Energie hauptsächlich durch Glykolyse gewonnen wird, während dies bei M2-Monozyten über oxidative Wege geschieht30. Um die proangiogenen Mechanismen in der Monozytenfraktion weiter zu untersuchen, verglichen wir die Genexpressionsprofile, die mit der Regulierung der Zellmigration bei der Keimangiogenese (GO:0090049) in Monozytenclustern von OP9-vorkonditioniertem UCB und rohem UCB verbunden sind. Die Gene wurden im Monozytencluster von OP9-vorkonditioniertem UCB weitgehend hochreguliert (Tabelle 1). Unter diesen Genen war die Expression von Neuropilin-1 (Nrp1) in der mit OP9 vorkonditionierten Monozytenfraktion im Vergleich zu der in rohem UCB erhöht. Nrp1 ist ein Transmembranrezeptor, der an VEGF165 und Klasse-3-Semaphorin bindet und bekanntermaßen in einer bestimmten proangiogenetischen Population von Monozyten exprimiert wird (z. B. Neuropilin-1-exprimierende Monozyten; NEM)31. Daher könnten die proangiogenen Mechanismen der OP9-vorkonditionierten Monozytenfraktion teilweise durch die Verstärkung von NEM durch die OP9-Vorkonditionierung erklärt werden.

Um die Ergebnisse von scRNA-seq zu untermauern, untersuchten wir die M1/M2-Phänotypverschiebung dieser beiden Monozytenfraktionen mithilfe einer Durchflusszytometrieanalyse. Zunächst bewerteten wir die Lebensfähigkeit von UCB-Zellen mithilfe der 4′,6-Diamino-2-phenylindol (DAPI)-Färbung. Dabei zeigte sich, dass die Lebensfähigkeit von UCB-Zellen in OP9-vorkonditioniertem UCB höher war als in rohem UCB (96,1 % gegenüber 81,3 %). % aller Ereignisse; Abb. 3c), was auf die schützende Wirkung von OP9 schließen lässt. CD80 und CD206 wurden zur Differenzierung von M1- und M2-Monozyten32,33 verwendet. Der Prozentsatz der Zellzahl vom Typ CD80-CD206+ M2 war in der Monozytenfraktion aus OP9-vorkonditioniertem UCB im Vergleich zu der aus rohem UCB viel höher (27,9 % vs. 1,7 %; Q1-Quadrant in Abb. 3c), während der Prozentsatz der Die Gesamtzahl der monozytischen Zellen war sowohl bei vorkonditionierten OP9-Zellen als auch bei rohen, von UCB abgeleiteten Zellen vergleichbar (3,3 % vs. 2,2 % aller lebenden Zellen; P2-Population in Abb. 3c).

Darüber hinaus beobachteten wir aufgrund der OP9-Vorkonditionierung eine deutliche Tendenz zur M1-M2-Verschiebung bei PB-MNCs. Der Anteil der CD80−CD206+-Zellen war wesentlich höher (43,0 % vs. 7,6 %; Q1-Quadrant in Abb. 3d), während der Anteil der CD80+ CD206−-Zellen niedriger war (3,3 % vs. 11,4 %; Q4-Quadrant in Abb. 3d). in der Monozytenfraktion von OP9-vorkonditionierten PB-MNCs im Vergleich zu der von rohen PB-MNCs (Abb. 3d).

In mehreren Granulozytenclustern von scRNA-seq war der Anteil an Granulozyten in OP9-vorkonditionierten UCB-Zellen höher als in den rohen UCB-Zellen (Granulozyten_3, 4 und _5, ergänzende Abbildung 1). Ähnlich wie Monozyten ist auch bei Neutrophilen bekannt, dass sie einen N2-Phänotyp haben, der die Angiogenese induziert34. Daher führten wir die gleiche Durchflusszytometrieanalyse in der Granulozytenfraktion durch (P2-Population, gesteuert durch SSC- und FSC-Eigenschaften in ergänzender Abbildung 2). Allerdings wurden Zellen vom Typ CD80-CD206+ N2 nur in 0,12 % der Granulozytenfraktion in OP9-vorkonditioniertem UCB gefunden (Q1-Quadrant in ergänzender Abbildung 2).

Insgesamt verschob die 24-stündige Kurzzeit-OP9-Vorkonditionierung die phänotypischen Eigenschaften der Monozytenfraktion in UCB-Zellen und PB-MNCs stark in Richtung des M2-dominanten Zustands sowie ihre Schutzwirkung im Hinblick auf die Lebensfähigkeit der UCB-Zellen.

Die proangiogene Wirkung von OP9-vorkonditionierten UCB-Zellen wurde durch intravenöse Verabreichung im MCAO-Mausmodell bewertet. Der Reparaturprozess, vor allem die Angiogenese, findet in der subakuten Phase nach einem Hirninfarkt statt35,36. Daher verabreichten wir 2 Wochen nach der MCAO-Induktion OP9-vorkonditionierte UCB-Zellen, um den angiogenen Prozess zu verstärken, und opferten diese MCAO-Mäuse 3 Monate nach der UCB-Verabreichung (Abb. 1b), wobei wir berücksichtigten, dass die Dichte der Mikrogefäße in der Periinfarktläsion angegeben wurde erreicht am 30. Tag seinen Höhepunkt und nimmt innerhalb von 3 Monaten allmählich ab37. Die morphologischen Beobachtungen beim fokalen ischämischen Infarkt ähnelten denen im vorherigen Bericht38, mit kleinen Arterien in der Gehirnoberfläche des ischämischen Infarkts und Mikrogefäßen in der Periinfarktläsion, die sich an der Peripherie des ischämischen Infarkts neben dem normalen Kortex befanden und Striatum (Abb. 4a). Wir haben die Dichte der Mikrogefäße in der Periinfarktläsion durch Flächenmessung und Zellzählung von CD31+/vWF+-Zellen (von Willebrand-Faktor) beurteilt. Der doppelt positive CD31/vWF-Bereich war in der OP9-vorkonditionierten UCB-verabreichten Gruppe (n = 5) signifikant höher als in der Vehikelkontrolle (n = 5) (***p < 0,001; Abb. 4b, c ). Dieses Ergebnis legt nahe, dass OP9-vorkonditionierte UCB-Zellen im Vergleich zu rohen UCB-Zellen deutliche proangiogene Wirkungen auf die Periinfarktläsion von MCAO-Mäusen hatten.

vWF- und CD31-Färbung in der Periinfarktläsion von MCAO-Mäusen mit oder ohne OP9-vorkonditionierter UCB-Verabreichung. Die fluoreszierende Immunhistochemie wurde 3,5 Monate nach der Operation durchgeführt (n = 5 in der UCB + OP9-Gruppe bzw. n = 5 in der Kontrollgruppe). (a) Schematische Darstellung der Zielregion für die Flächenmessung von CD31/vWF (von Willebrand-Faktor) doppelt positiven Zellen durch ein Fluoreszenzmikroskop. Ein koronaler Abschnitt pro Maus (n = 5 in jeder Gruppe) wurde analysiert. Es wurden kleine Arterien in der Hirnoberfläche des ischämischen Infarkts (‡) und Mikrogefäße in der Periinfarktläsion am Rand des ischämischen Infarkts neben dem normalen Kortex und Striatum (†) beobachtet. Drei nicht überlappende zufällige Gesichtsfelder von (†), angezeigt durch rote ausgefüllte Kästchen (400-fache Vergrößerung) pro Koronalschnitt, wurden analysiert, um den doppelt positiven CD31/vWF-Bereich zu messen. (b) Repräsentative Bilder der Immunfluoreszenzfärbung von Gehirnschnitten. CD31/vWF-doppelt positive Zellen (gelb) mit CD31+ (grün) und vWF+ (rot) in den Periinfarktläsionen (†) wurden der Analyse in (c) unterzogen. Die Kerne wurden mit DAPI (blau) gegengefärbt. Maßstabsbalken: 50 μm. 200-fache Vergrößerung. (c) Die Flächenmessung und Zellzahl von CD31+/vWF+-Zellen pro Feld, beobachtet in 400-facher Vergrößerung (n = 15 pro Gruppe). ***p < 0,001, ungepaarter t-Test.

Schließlich führten wir Verhaltenstests an MCAO-Mäusen durch, um die Auswirkungen von OP9-vorkonditioniertem UCB auf die Verbesserung neurologischer Störungen, die durch einen Hirninfarkt verursacht wurden, zu bewerten. Verhaltenstests wurden 1,5 Monate nach der Operation durchgeführt und innerhalb von drei Gruppen verglichen [der UCB + OP9-Gruppe (n = 11), der Kontrollgruppe (n = 11) und der Scheinoperationsgruppe (n = 12)], wie in Abb . 1c.

Vor mehreren Vergleichen wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) für die Y-Labyrinth-Aufgabe durchgeführt, die eine Signifikanz zeigte [F(2) = 19,35, p < 0,0001]. Darüber hinaus ergab eine Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen (rmANOVA) (d. h. der Test auf offenem Feld, die Lernaufgabe zum passiven Vermeiden und der Test zum erzwungenen Schwimmen) eine Signifikanz in den Gruppen bei allen Aufgaben [F(2, 32) = 10,60, p < 0,0003; F(2, 32) = 6,08, p = 0,0058; F(2, 32), p < 0,0001], sowie im Zeiteffekt der passiven Vermeidungslernaufgabe [F(2, 31) = 14,48, p < 0,0001] und der Gruppen-nach-Zeit-Interaktion im erzwungenen Schwimmtest [F(10, 160) = 3,179, p = 0,001]. Allerdings zeigte rmANOVA im Drahthängungstest keine Signifikanz.

Für mehrere Vergleiche verglichen wir zunächst die Kontroll- und die Scheinoperationsgruppe, um zu beurteilen, ob die MCAO-Induktion die Punktzahl jedes Verhaltenstests beeinflusste und ob diese Tests geeignet waren, durch MCAO verursachte abnormale neurologische Funktionen zu erkennen. Im Freilandtest war die zurückgelegte Distanz in der Kontrollgruppe während der gesamten Versuchsdauer signifikant höher als in der Gruppe mit Scheinoperationen, was einen abnormalen Mangel an Gewöhnung und Angst in der Kontrollgruppe widerspiegelt (*p < 0,05, **p < 0,01). , ***p < 0,001; Abb. 5a). Obwohl der Zeiteffekt in rmANOVA statistisch nicht signifikant war, wurde in der Scheinoperationsgruppe ein Trend zu einer zeitabhängigen Verringerung der zurückgelegten Strecke beobachtet, was auf eine normale Gewöhnungsreaktion im Freilandtest hinweist. Bei der Y-Labyrinth-Aufgabe verringerte sich die Wechselrate in der Kontrollgruppe im Vergleich zu der in der Scheinoperationsgruppe signifikant, was auf eine Beeinträchtigung des Arbeitsgedächtnisses in der Kontrollgruppe schließen lässt (*p < 0,05; Abb. 5b). Darüber hinaus verlängerte sich bei der passiven Vermeidungslernaufgabe die Durchtrittslatenz in der Scheinoperationsgruppe nach jedem Versuchstag, während sich die in der Kontrollgruppe nicht änderte, was darauf hindeutet, dass Mäuse in der Scheinoperationsgruppe erfolgreich Vermeidungsverhalten erlangten, aber Mäuse in der Kontrollgruppe taten dies nicht, was auf eine Beeinträchtigung des nozizeptiven Gedächtnisses zurückzuführen sein kann (††p < 0,01, *p < 0,05, Abb. 5c). Der Test zum erzwungenen Schwimmen zeigte, dass Mäuse in der Scheinoperationsgruppe eine kürzere Immobilitätszeit aufwiesen als Mäuse in der Kontrollgruppe, was auf die Entwicklung eines Motivationsverlusts und einer Beeinträchtigung der Belastungstoleranz bei MCAO-Mäusen hinweist (**p < 0,01, *** p < 0,001; Abb. 5e).

Verhaltenstests für MCAO-Mäuse mit oder ohne OP9-vorkonditionierte UCB-Verabreichung. Die Mäuse wurden zufällig drei Gruppen zugeteilt: der UCB + OP9-Gruppe (n = 11), der Kontrollgruppe (n = 11) und der Scheinoperationsgruppe (n = 12). Der Freilandtest (a), die Y-Labyrinth-Aufgabe (b), der passive Vermeidungslerntest (c), der Drahtseiltest (d) und der Zwangsschwimmtest wurden 1,5 Monate nach der Operation durchgeführt. Vor mehreren Vergleichen eine einseitige Varianzanalyse für die Y-Labyrinth-Aufgabe und eine zweifache, wiederholt gemessene ANOVA für Daten, die aus wiederholten Messungen stammen (d. h. dem Open-Field-Test, der Lernaufgabe zur passiven Vermeidung, dem Wire-Hang-Test und dem erzwungenen Test). Schwimmtest) verwendet. A; p < 0,05, Dunnett-Test für Unterschiede zwischen Subjekten. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, Dunnett-Test im Vergleich der Scheinoperationsgruppe mit der Kontrollgruppe (dh der MCAO-induzierten Gruppe). #p < 0,05, ##p < 0,01, Dunnett-Test im Vergleich der OP9 + UCB-Gruppe (dh der MCAO-induzierten und OP9-vorkonditionierten UCB-verabreichten Gruppe) mit der Kontrollgruppe. †p < 0,05, ††p < 0,01, Dunnett-Test im Vergleich mit den Konditionierungsversuchen jeder Gruppe.

Als nächstes verglichen wir die Kontroll- und OP9 + UCB-Gruppen, um die verbessernden Auswirkungen von OP9-vorkonditionierten UCB-Zellen auf Verhaltensaufgaben-Scores zu untersuchen. Die Ergebnisse beim Open-Field-Test, dem Y-Labyrinth-Test, der Lernaufgabe zur passiven Vermeidung und dem Test zum erzwungenen Schwimmen waren in der OP9 + UCB-Gruppe signifikant besser als in der Kontrollgruppe (#p < 0,05, ##p < 0,01, † †p < 0,01). Im Wire-Hang-Test konnten wir keine signifikanten Unterschiede zwischen den drei Gruppen feststellen (Abb. 5d), da unser MCAO-Modell bekanntermaßen eine schnelle Erholung von fokalen motorischen Defiziten zeigt und nicht immer ausreicht, um verbessernde Auswirkungen auf die motorische Funktion festzustellen39,40 . Es gab jedoch einen Trend, dass die Latenzzeit bis zum Sturz durch die MCAO-Induktion verkürzt wurde (d. h. kürzer in der Kontrollgruppe als in der Scheinoperationsgruppe) und durch die Verabreichung von OP9-vorkonditionierten UCB-Zellen verbessert wurde (d. h. länger in der Kontrollgruppe). OP9 + CUB-Gruppe als in der Kontrollgruppe), was auf eine verbessernde Wirkung von OP9-vorkonditionierten UCB-Zellen bei Muskelschwäche und Belastungstoleranz hindeutet. Daher deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die durch MCAO verursachten Verhaltensstörungen, wie allgemeine Aktivität, Gedächtnisstörungen, Belastungstoleranz und Depressionssymptome, durch die Verabreichung von OP9-vorkonditionierten UCB-Zellen verbessert wurden.

Die aktuelle Studie zeigte, dass OP9 die proangiogenen Eigenschaften von UCB-Zellen stark und schnell steigerte (Abb. 2), teilweise durch Verschiebung ihres Phänotyps in der Monozytenfraktion in Richtung eines angiogenen M2-dominanten Status (Abb. 3). Es wurde auch gezeigt, dass die subakute intravenöse Verabreichung von OP9-vorkonditionierten UCB-Zellen die neurologischen Defizite im MCAO-Mausmodell linderte (Abb. 5), was teilweise auf die Förderung der angeborenen Angiogenese in Periinfarktläsionen zurückzuführen ist (Abb. 4). Nach unserem besten Wissen ist dies die erste Studie, die über eine starke, einfache und schnelle Modifikationstechnik für UCB berichtet, um seine proangiogenen Eigenschaften zu verstärken und seine biologischen Wirkungen in einem Modell für subakuten Hirninfarkt zu überprüfen.

Asahara et al. beschrieb erstmals die Nomenklatur endothelialer Vorläuferzellen (EPC), einer zirkulierenden Zellpopulation, die zur Neovaskularisierung beitragen kann, indem sie sich an den Stellen der aktiven Angiogenese ansammelt6. In In-vitro-Zellkulturtests werden zwei verschiedene EPC-Populationen gemeldet: frühe und späte EPCs, wobei erstere auch als myeloische angiogene Zellen (MACs) oder proangiogene hämatopoetische Zellen bezeichnet werden, während letztere auch als endotheliale koloniebildende Zellen bezeichnet werden ( ECFCs) oder endotheliale Auswuchszellen41,42. Bei beiden handelte es sich um adhärente Zellen, die aus PB-MNCs isoliert wurden, die unter Endothelzellkulturbedingungen auf Fibronektin oder Kollagen-beschichteten Schalen ausplattiert wurden, sich jedoch in der Zeit ihres Entstehens in der Kultur unterschieden26,29,43,44. Ursprünglich wurde berichtet, dass es sich bei der frühen EPC um eine spindelförmige Zellpopulation handelte, die nach 2–3 Wochen entstand und nach 4 Wochen aufhörte, während die späte EPC eine kopfsteinförmige Zellpopulation war, die nach 2–3 Wochen entstand und nach 4–8 Wochen exponentiell wuchs hatten die Fähigkeit zu mehrfachen Populationsverdoppelungen ohne Seneszenz27. ECFCs verfügen über spezifische endotheliale Vorläufereigenschaften, wie z. B. eine signifikante Proliferationskapazität, ein Netzwerkbildungspotenzial in Matrigel und die Fähigkeit, in vivo zur De-novo-Blutgefäßbildung beizutragen26,29,45. Im Gegensatz dazu teilen MACs keine der Eigenschaften von ECFCs, weisen jedoch hämatopoetisch abgeleitete monozytische Merkmale auf (d. h. die Expression myeloischer Vorläuferzellmarker und die Fähigkeit zur Differenzierung in Makrophagen) und fördern die Angiogenese durch einen parakrinen Mechanismus12,43,44,45 ,46.

Basierend auf früheren Studien enthalten MACs eine Monozytenfraktion und besitzen ähnliche Eigenschaften wie Zellpopulationen, die häufig für Zelltherapien zur Förderung der Angiogenese verwendet werden14. Unsere vorkonditionierten OP9-UCB-Zellen enthalten auch eine Monozytenfraktion, die die Eigenschaften von MACs besitzt, wie z. B. proangiogene Wirkung durch einen parakrinen Mechanismus. Im Netzwerkbildungstest bildeten jedoch OP9-vorkonditionierte UCB-Zellen eine Netzwerkstruktur und richteten sich heterogen mit HUVECs aus, wohingegen PB-MNCs keine Netzwerkstruktur bildeten, obwohl sich sowohl PB-MNCs als auch UCB-Zellen durch Verwendung in Richtung des M2-Phänotyps verschoben OP9-Vorkonditionierung. Daher erscheint es angemessen, unsere Ergebnisse im Netzwerkbildungstest wie folgt zu interpretieren: (i) unsere OP9-Vorkonditionierung verschob die Monozytenfraktion in UCB-Zellen in Richtung des M2-Phänotyps und verstärkte deren proangiogene Wirkung, (ii) diese Monozyten differenzierten sich nicht in Endothelzellen, und (iii) die OP9-Vorkonditionierung könnte dazu führen, dass eine andere undefinierte Population in UCB-Zellen heterogen mit HUVECs teilnimmt und sich an der Kernstruktur des Netzwerks ausrichtet, unterstützt durch umgebende M2-verschobene proangiogene Monozyten. Frühere Berichte zeigten, dass MACs und ECFCs einen synergistischen Effekt auf die Neovaskularisation hatten43 und unfraktionierte UCB-abgeleitete mononukleäre Zellen waren CD34+- oder CD34--Zellfraktionen hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf die Reduzierung des Infarktvolumens und die Verbesserung neurologischer Defizite überlegen21. Daher legen diese Ergebnisse nahe, dass unsere Methode unter Verwendung unfraktionierter UCB-Zellen, die zusammen mit OP9 kultiviert wurden, ein besserer Ansatz zur Steigerung der angiogenetischen Merkmale wäre, bei dem mehrere angiogene Zellpopulationen im Zusammenhang mit der Angiogenese gleichzeitig durch OP9 enthalten und moduliert wurden, ohne eine bestimmte Zellpopulation zu isolieren.

Unter den verschiedenen Zellquellen hat UCB einige Vorteile in der klinischen Anwendung als Spenderquelle für die Zelltherapie, insbesondere wenn es um Neovaskularisation geht. Erstens enthält UCB Stammzellen mit einem hohen Proliferationspotential47. Zweitens enthält UCB eine höhere Menge an proangiogenen Zellpopulationen als PB oder Knochenmark48,49. Drittens wird die UCB-Transplantation schon seit langem in Kliniken eingesetzt50 und weist eine geringere Inzidenz und Schwere der Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung auf als die Knochenmarktransplantation51,52. Schließlich wird UCB weniger invasiv und einfach gewonnen, da es normalerweise nach der Geburt entsorgt wird, und es wurde ein stabiles Versorgungssystem etabliert. Diese Eigenschaften unterstützen unseren Ansatz zur Verwendung und Modulation von UCB in der Zelltherapie.

Mehrere Studien haben gezeigt, dass M2-Makrophagen durch Co-Kultur mit mesenchymalen Stammzellen (MSCs) erzeugt werden können53,54,55. Darüber hinaus könnten von MSC abgeleitete Überstände Makrophagen in Richtung eines entzündungshemmenden Phänotyps verstärken, und die Verabreichung solcher „gebildeter Makrophagen“ verbesserte den Heilungsprozess von Sehnenverletzungen erheblich, verringerte das endogene M1/M2-Makrophagen-Verhältnis und förderte die Angiogenese56.

OP9 ist weithin als Feederzelle zur Förderung der hämatoendothelialen Differenzierung bekannt, es ist jedoch auch bekannt, dass es einige charakteristische Merkmale mit MSCs gemeinsam hat, darunter den Immunphänotyp, die Fähigkeit zur Differenzierung und immunmodulierende Wirkungen57. Die zugrunde liegenden Mechanismen der OP9-Vorkonditionierung in UCB-Zellen könnten eher auf die „Monozytenbildung“ als auf die Differenzierung von Stamm- und Vorläuferzellen zurückzuführen sein, wenn man bedenkt, dass wir UCB nur 1 Tag lang gemeinsam mit OP9 kultiviert haben, während es normalerweise Tage dauert, bis myelomonozytische Zellen erhalten sind durch Differenzierung aus embryonalen Stammzellen mittels OP958.

Obwohl die zugrunde liegenden proangiogenen molekularen Mechanismen von in vivo M2-verschobenen Monozyten nicht geklärt wurden, konnte aus dem Expressionsprofil der Monozytenfraktion in scRNA-seq eine interessante Erkenntnis gewonnen werden. Die Expression von Nrp1 war in der mit OP9 vorkonditionierten Monozytenfraktion im Vergleich zu der in rohem UCB verstärkt. Kürzlich haben mehrere Studien gezeigt, dass (i) eine bestimmte Population von Monozyten Nrp1 als Transmembranrezeptor exprimierte (d. h. Neuropilin-1-exprimierende Monozyten; NEM), (ii) Nrp1 an VEGF165 und Klasse-3-Semaphorin gebunden war und eine Chemo-Anziehung vermittelte von NEMs in Richtung der Stelle der Neoangiogenese, und (iii) NEMs könnten glatte Muskelzellen rekrutieren, die Gefäßreifung in der Arterienbildung fördern und abnormale Gefäßpermeabilität verringern, obwohl NEMs selbst nicht in die Gefäßstruktur eingebaut waren31,59,60,61.

Die aktuelle Studie wies bestimmte Einschränkungen auf. Erstens haben wir den Unterschied in der Wirkung auf den ischämischen Schlaganfall zwischen vorkonditioniertem OP9 und rohem UCB nicht bewertet. Zweitens ist es notwendig, die Wirkung von OP9 auf andere Zellpopulationen als die monozytische Fraktion zu bewerten, obwohl dies den Rahmen dieses Manuskripts sprengt, wie z. B. UCB-abgeleitete AC133+-Vorläuferzellen5,62 oder UCB-abgeleitete ECFC26 sowie T Zelluntergruppen, von denen berichtet wurde, dass sie die neurologische Erholung nach einem Schlaganfall behindern21,63. In dieser Hinsicht könnte eine weitere Analyse von Genexpressionsprofilen mithilfe von scRNA-seq Hinweise zur Beantwortung dieser Fragen liefern. Drittens haben wir weder die Transplantation von verabreichtem UCB im Gehirn überprüft noch untersucht, ob sich diese von UCB abgeleiteten Zellen differenzierten und an der Struktur reparierter Gewebe beteiligt waren. Mehrere Berichte haben die Transplantation von UCB-abgeleiteten Zellen gezeigt18,20,62,64,65, während einige Berichte fehlschlugen21,22. Auch ihre Differenzierungsfähigkeit ist umstritten. Die Diskrepanzen in diesen Ergebnissen sind teilweise auf Unterschiede im Zeitplan der UCB-Verabreichung nach dem Infarkt (24 Stunden – 1 Woche nach MCAO), im Verlauf der histologischen Analyse (1 Woche – 1 Monat) und in der Methode zum Nachweis menschlicher UCB-Zellen zurückzuführen. Dennoch können die Mechanismen der Symptomverbesserung in der aktuellen Studie teilweise durch die proangiogene Wirkung von OP9-vorkonditionierten UCB-Zellen auf den angeborenen Gewebereparaturprozess erklärt werden, über den bereits berichtet wurde17,19,62.

Obwohl diese Einschränkungen bestehen, zeichnet sich unsere OP9-Vorkonditionierungsmethode immer noch durch ihre schnellen, bequemen und durchführbaren Funktionen sowie ihre starke Wirkung auf die Modulation der Bioaktivität von UCB gegenüber M2, einem proangiogenen, gewebeschützenden Phänotyp, aus .

In dieser Studie haben wir eine starke und schnelle Methode gefunden, um die proangiogenen und gewebeschützenden M2-Eigenschaften von UCB durch Co-Kultivierung mit OP9 zu verstärken. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die subakute Verabreichung von OP9-vorkonditioniertem UCB die durch MCAO verursachten Verhaltensdefizite in einem Mausmodell verbesserte, teilweise durch Förderung der angeborenen Angiogenese in Periinfarktläsionen.

Von allen Spendern, die UCB oder PB zur Verfügung stellten, wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt, und das Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission der Hyogo Medical University (Genehmigungsnummer 0325) genehmigt und gemäß der Deklaration von Helsinki durchgeführt.

OP9-Zellen wurden von Dr. Nobuyuki Takakura (Abteilung für Signaltransduktion, Forschungsinstitut für mikrobielle Krankheiten, Universität Osaka, Japan) erhalten und in α Minimum Essential Medium mit Nukleosiden (Thermo Fisher Scientific, 41061-029; Waltham, MA) ergänzt gehalten 20 % fötales Rinderserum (Biowest, S1820; Nuaille, Frankreich) und Penicillin-Streptomycin (Sigma-Aldrich, P7539; St. Louis, MO, USA).

Aus menschlicher Nabelschnur stammende HUVECs wurden von Lonza (C2517A; Basel, Schweiz) gekauft und in EGM-2-Medium (CC-3162; Lonza) gehalten.

RBC-abgereicherte UCB- und PB-MNCs wurden unter Verwendung des EasySep RBC Depletion Reagent (Stem Cell Technologies, Vancouver, Kanada) und Ficoll-Paque PLUS (Cytiva, 17144002, MA) gemäß dem Protokoll des Herstellers erhalten. Die Zellen wurden in DMEM/F12 (Thermo Fisher Scientific, 11330-032) resuspendiert, ergänzt mit epidermalem Wachstumsfaktor (Peprotech, AF100-15; Cranbury, NJ), Fibroblasten-Wachstumsfaktor Basic (Peprotech, 100-18B), N-2 ( Thermo Fisher Scientific, 17502048) und antibiotisch-antimykotisch (Thermo Fisher Scientific, 15240-062) und co-kultiviert auf OP9-Stromazellen (d. h. OP9-Vorkonditionierung) in 10-cm-Kulturschalen bei einer Dichte von 1 × 106 Zellen /cm2. Nach 18–24 Stunden Kultur wurden nicht anhaftende Zellen entfernt und anhaftende Zellen durch Trypsinisierung geerntet, einmal mit Medium gewaschen und dann einem In-vitro-Netzwerkbildungstest, einer Durchflusszytometrieanalyse und einer intravenösen Verabreichung im Mausmodell unterzogen. Für scRNA-seq wurde nach OP9-Vorkonditionierung eine Kombination aus adhärenten und überstehenden Zellen verwendet, die aus UCB mit RBC-Abreicherung stammten. Als Kontrollen für den Netzwerkbildungstest wurden adhärente Zellen verwendet, die aus rohem, auf Fibronektin-beschichteten Schalen kultiviertem, von Erythrozyten befreiten UCB stammten. Umgekehrt wurden RBC-arme UCB-Rohzellen und PB-MNCs als Kontrolle für die scRNA-seq- und/oder Durchflusszytometrieanalyse verwendet.

Von UCB oder PB abgeleitete adhärente Zellen mit oder ohne OP9-Vorkonditionierung wurden auf mit Matrigel-Matrix (Corning Inc., 354234; Corning, NY, USA) beschichtete Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen in einer Dichte von 1 × 105 Zellen pro ausgesät Also. DMEM (Thermo Fisher Scientific, 11885-084) mit 5 % UCB-Serum wurde zugegeben und nach 24-stündiger Inkubation bei 37 °C mit 5 % CO2 wurden die Zellen unter Verwendung eines Umkehrmikroskops (BZ-X710, Keyence Corporation, Osaka, Japan) beobachtet ; DMi8, Leica Microsystems, Watzler, Deutschland) bei 10-facher Vergrößerung für kapillarartige Bildung, definiert als miteinander verbundene Netzwerkstrukturen.

Für die Co-Kultur-Experimente wurden HUVECs mit einem rot fluoreszierenden Membranmarkierungskit (Sigma-Aldrich, MINI26) gemäß dem Protokoll des Herstellers markiert. HUVECs wurden mit 1 × 105 Zellen adhärenter Zellen in Matrigel im Verhältnis 1:5 gemischt.

Der Aufbau der RNA-seq-Bibliothek und die cDNA-Sequenzierung, einschließlich Einzelzellisolierung, Vorbereitung der cDNA, Aufbau der RNA-seq-Bibliothek, cDNA-Sequenzierung und Verarbeitung, wurden von der NGS-Kerneinrichtung des Genome Information Research Center an der Universität Osaka (Osaka, Japan) durchgeführt. Japan). Die aus scRNA-seq abgeleitete Analyse und grafische Darstellung wurde von Genble Inc. (Fukuoka, Japan) durchgeführt. Einzelheiten sind in der ergänzenden Methode 3 beschrieben.

Die Zellen wurden 20 Minuten lang bei 26 °C im Dunkeln mit fluoreszierenden konjugierten Antikörpern (wie in Tabelle 2 angegeben) inkubiert und zweimal mit PBS gewaschen. Vor der Analyse wurden die Zellen mit Cellstain-DAPI-Lösung (1:500, Dojindo, 340-07971; Kumamoto, Japan) gefärbt, um abgestorbene Zellen zu entfernen. Nach der Färbung wurden die Zellen zur Analyse mit FACSAriaIII (BD Biosciences) in 500 μl FACS-Puffer resuspendiert. Die durchflusszytometrische Datenanalyse wurde mit der FACSDiva-Software (BD Biosciences) durchgeführt. Für jede Probe wurden mindestens 20.000 Ereignisse aufgezeichnet. Nicht gefärbte Zellen wurden als Kontrollproben verwendet, um geeignete Einstellungen für die Datenanalyse zu bestimmen.

Das experimentelle Verfahren wurde vom Animal Care Committee des Hyogo College of Medicine genehmigt (Genehmigungsnummer: 19-040) und gemäß den ARRIVE-Richtlinien und dem „Guide for the Care and Use of Laboratory Animals“, veröffentlicht von der National Academy of Science of Science, durchgeführt die USA. Sieben bis neun Wochen alte männliche CB-17/Icr-+/+Jcl-Mäuse (CLEA Japan Inc., Tokio, Japan) wurden in einem Raum mit kontrollierter Temperatur (22–24 °C) und Luftfeuchtigkeit (55 %) gehalten ein 12/12-Hell-Dunkel-Plan. Die Tiere hatten freien Zugang zu Wasser und Standard-Pelletfutter nach Belieben.

Mäuse wurden wie folgt zufällig drei Gruppen zugeteilt: der UCB + OP9-Gruppe (MCAO, gefolgt von der Verabreichung von OP9-vorkonditioniertem UCB; n = 11); die Kontrollgruppe (die Vehikel-Kontrollgruppe erhielt nach MCAO allein Ringer-Laktat-Lösung; n = 11) und die Scheinoperationsgruppe (n = 12). Zwei Wochen nach der Operation erhielten Mäuse in der UCB + OP9-Gruppe 100 μl OP9-vorkonditioniertes UCB (2,0 × 107 Zellen/kg) und Mäuse in der Kontrollgruppe erhielten die gleiche Menge Ringer-Laktat-Lösung über die Halsschlagader unter direkter Sicht .

Ein dauerhafter fokaler Hirninfarkt wurde durch MCAO wie zuvor beschrieben induziert40. Kurz gesagt, unter Vollnarkose mit 2 % Isofluran (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, 099-06571; Osaka, Japan) wurde eine Haut zwischen dem linken Auge und dem linken Ohr eingeschnitten. Nach der Entfernung des linken Jochbeins mit einem Zahnbohrer unter einem Operationsmikroskop wurde auf der Schädeloberfläche ein Knochenfenster mit einem Durchmesser von 1,5 mm erzeugt. Schließlich wurde der proximale Teil der mittleren Hirnarterie in der Nähe der Schädelbasis freigelegt und direkt distal des Riechtrakts abgeschnitten. Es ist bekannt, dass dieses in der aktuellen Studie verwendete MCAO-Modell selbst in der chronischen Phase (d. h. 14 Tage nach der MCAO-Induktion) einen klar abgegrenzten reproduzierbaren Schlaganfallbereich aufweist66.

Immunsuppressiva wurden nicht verabreicht, da bekannt ist, dass UCB eine geringe Immunogenität aufweist, und mehrere Studien haben über eine Transplantation nach Xenotransplantation ohne Immunsuppressiva berichtet20,67.

Drei Monate nach der Zelltransplantation wurden fünf Mäuse in der UCB + OP9-Gruppe und fünf in der Kontrollgruppe nach Vollnarkose mit Isofluran (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) transkardial mit PBS und 4 % Paraformaldehyd (PFA) perfundiert. Die Gehirne wurden entnommen und über Nacht in 4 % PFA fixiert, in 30 % Saccharose dehydriert, bei –80 °C eingefroren und mit einem Kryostat (NX70; PHC, Tokio, Japan) in koronale Schnitte von 10 μm geschnitten. Gefrorene Schnitte wurden dreimal jeweils 3 Minuten lang mit PBS gewaschen, mit Blocking One Histo (Nacalai Tesque, 06349-64; Kyoto, Japan) blockiert, 10 Minuten lang mit 1 % Triton X-100 in PBS permeabilisiert und zweimal mit gewaschen PBS für jeweils 5 Minuten. Die Schnitte wurden dann über Nacht bei 4 °C mit einem Anti-CD31-Antikörper (1:50; BioLegend, 160.202; San Diego, CA) und einem Anti-vWF-Antikörper (1:50; Cell Signaling Technologies, 65.707; Danvers, MA). Alexa Fluor 488- und 647-konjugierte Antikörper (Thermo Fisher Scientific, SA5-10327; Cell Signaling Technologies, 4416) wurden als Sekundärantikörper für einen Anti-CD31- bzw. Anti-vWF-Antikörper verwendet und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Kerne wurden mit DAPI (SeraCare, 71-03-01; Milford, IA, USA) gegengefärbt. CD31/vWF-doppelt positive Zellen in der Periinfarktläsion wurden als Endothelzellen erkannt, die Mikrogefäße bilden62,68,69,70. Histologische Bilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop BZ-X710 (Keyence Corporation; Osaka, Japan) bei 400-facher Vergrößerung aufgenommen, um den doppelt positiven CD31/vWF-Bereich zu messen. Fünfzehn Felder pro Gruppe (drei nicht überlappende zufällige Gesichtsfelder pro Koronalabschnitt und ein Koronalabschnitt pro Maus; n = 5 in jeder Gruppe) wurden analysiert. Die Flächenmessung und Zellzahl dieser Zellen wurde automatisch in jedem aufgenommenen Bild mithilfe der Hybridzellzahl-Software BZ-X-Analysator in jedem Gesichtsfeld (Keyence Corporation) durchgeführt.

Einen Monat nach der Zelltransplantation wurden Verhaltensaufgaben durchgeführt (wie in der ergänzenden Methode angegeben), um die funktionellen Defizite und die Erholung der Tiere nach MCAO zu beurteilen [die UCB + OP9-Gruppe (n = 11), die Kontrollgruppe (n = 11) und die Scheinoperationsgruppe (n = 12)]. Basierend auf unserer vorherigen Studie unter Verwendung desselben Modells und derselben Verhaltensaufgaben71 ergab eine Pre-hoc-Power-Analyse, dass eine Stichprobengröße von zehn in jeder Gruppe ausreicht, um eine 80-prozentige Power zum Erkennen eines Unterschieds zwischen Subjekten zwischen drei Gruppen bei wiederholten Messungen zu haben ANOVA für das offene Feld, das Y-Labyrinth und den passiven Vermeidungslerntest. Verhaltensaufgaben wurden von unabhängigen Experimentatoren durchgeführt, die gegenüber den Experimentalgruppen blind waren. Es ist bekannt, dass in Mausmodellen nach einem fokalen Hirninfarkt eine abnormale Hyperaktivität beobachtet wird, die bis zu 2–3 Monate anhält72,73 und durch abnormale Angstzustände und Gewöhnungsstörungen nach wiederholter Exposition aufgrund von Gedächtnisstörungen verursacht wird74. In unseren Modellen können diese Verhaltensstörungen aufgrund von MCAO anhand der zurückgelegten Strecke im Freilandtest bewertet werden39. Muskelkraft und Belastungstoleranz wurden anhand der Sturzlatenz beim Wire-Hang-Test gemessen. Das räumliche Arbeitsgedächtnis und das angstbedingte emotionale Gedächtnis wurden mithilfe der Y-Labyrinth-75- bzw. passiven Vermeidungs-Lernaufgaben76 bewertet. Schließlich wurde ein Verlust der Motivation und der Belastungstoleranz mithilfe des Zwangsschwimmtests77 bewertet. Wir haben zuvor die Wirkung der MCAO-Induktion auf die Ergebnisse der Y-Labyrinth- und passiven Vermeidungs-Lernaufgaben in der chronischen Phase (d. h. 1–2 Monate nach der MCAO-Induktion) bestätigt71.

Alle Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) ausgedrückt und mit JMP Version analysiert. 13 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Unterschiede zwischen zwei Gruppen wurden mithilfe eines ungepaarten zweiseitigen t-Tests analysiert, wohingegen die Analyse in mehr als zwei Gruppen oder bei wiederholt gemessenen Werten mithilfe des Post-hoc-Dunnett-Tests durchgeführt wurde, wenn eine einfaktorielle ANOVA oder rmANOVA statistische Signifikanz zeigte. Bei der Durchführung des Dunnett-Tests wurden die Kontrollgruppe und die erste Sitzung als Kontrolle für die Vergleiche zwischen Gruppen bzw. für die Analyse der sitzungsspezifischen Unterschiede innerhalb des Probanden festgelegt. Die statistische Signifikanz wurde auf p < 0,05 festgelegt.

Die Autoren bestätigen, dass alle den Ergebnissen zugrunde liegenden Daten vollständig und uneingeschränkt verfügbar sind. Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

Die scRNA-seq-Daten wurden bei NCBI GEO mit der Zugangsnummer GSE207249 hinterlegt.

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Die Autoren danken Dr. Mariko Kamihigashi, Hiroyuki Tanaka, Hideaki Sawai und Hiroaki Shibahara, Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie, Hyogo Medical University für die Vorbereitung von menschlichem Nabelschnurblut. Die Autoren danken auch den Mitarbeitern der Joint-Use-Forschungseinrichtungen der Hyogo Medical University für die Erlaubnis, ihre Ressourcen, einschließlich des FACS-Analysegeräts, zu nutzen. Wir danken der NGS-Kerneinrichtung des Genome Information Research Center am Forschungsinstitut für mikrobielle Krankheiten der Universität Osaka und Genble Inc. für die Unterstützung bei der RNA-Sequenzierung und Datenanalyse.

Diese Arbeit wurde durch den JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (C) [Grant Number JP22K09221] unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Yasunori Yoshida und Yuki Takeda.

Abteilung für Neurochirurgie, Hyogo Medical University, 1-1 Mukogawa, Nishinomiya, Hyogo, 663-8501, Japan

Yasunori Yoshida, Yuki Takeda, Toshinori Takagi, Yoji Kuramoto und Shinichi Yoshimura

Labor für Molekular- und Zelltherapie, Institut für fortgeschrittene medizinische Wissenschaften, Hyogo Medical University, 1-1 Mukogawa, Nishinomiya, Hyogo, 663-8501, Japan

Kenichi Yamahara & Hanae Yamamoto

Labor für Neurogenese und ZNS-Reparatur, Institut für fortgeschrittene medizinische Wissenschaften, Hyogo Medial University, 1-1 Mukogawa, Nishinomiya, Hyogo, 663-8501, Japan

Akiko Nakano-Doi, Takayuki Nakagomi und Nobutaka Doe

Abteilung für Ergotherapie, School of Rehabilitation, Hyogo Medical University, 1-3-6 Minatojima, Chuo-Ku, Kobe, Hyogo, 650-8530, Japan

Nobutaka Doe

Abteilung für Hämatologie, Hyogo Medical University, 1-1 Mukogawa, Nishinomiya, Hyogo, 663-8501, Japan

Toshihiro Soma

Abteilung für therapeutischen Fortschritt bei Hirnerkrankungen, Hyogo Medical University, 1-1 Mukogawa, Nishinomiya, Hyogo, 663-8501, Japan

Tomohiro Matsuyama

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YT führte Experimente durch. YY analysierte und interpretierte die Daten und verfasste das Manuskript. HY und AD leisteten wesentliche Beiträge zur Durchführung von Experimenten. TN, TS und TM beteiligten sich an der experimentellen Gestaltung und Dateninterpretation. ND und YK leisteten wesentliche Beiträge zur Analyse von Verhaltensaufgaben. TT und KY haben das Manuskript überarbeitet. SY leistete wesentliche Beiträge zur Konzeption und Gestaltung der Studie. KY analysierte und interpretierte die Daten mit YY, genehmigte die endgültige Version des zu veröffentlichenden Artikels und erklärte sich bereit, für alle Aspekte der Arbeit verantwortlich zu sein. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Kenichi Yamahara.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Yoshida, Y., Takeda, Y., Yamahara, K. et al. Verbesserte angiogene Eigenschaften von Nabelschnurblut, das durch OP9-Stromazellen vorbereitet wurde, verbessern neurologische Defizite im Mausmodell mit Hirninfarkt. Sci Rep 13, 262 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-27424-7

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Eingegangen: 15. September 2022

Angenommen: 29. Dezember 2022

Veröffentlicht: 06. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-27424-7

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Verbesserte angiogene Eigenschaften von Nabelschnurblut, das durch OP9-Stromazellen vorbereitet wurde, verbessern neurologische Defizite im Mausmodell mit Hirninfarkt